摘要
家蚕（Bombyx mori）属于鳞翅目蚕蛾科，是一种重要的经济昆虫，也是鳞翅目昆虫的一种模式生物。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus， BmNPV ）感染引起核型多角体病毒病，每年给养蚕业造成极大的经济损失。MicroRNAs（miRNAs）是一类短链非编码 RNAs，通过转录后表达调控从而参与发育、代谢、免疫等各种生物学进程。已有研究表明病毒感染会导致宿主 miRNAs 的表达谱发生变化，并且已有不少 miRNAs被发现在宿主-病原体相互作用中发挥重要作用。本研究以 BmNPV抗性家蚕品系 A35和感性家蚕品系 P50为材料，通过转录组测序技术对两个家蚕品系感染 BmNPV 后中肠的转录组以及 small RNA 进行了高通量测序，分析差异表达的mRNAs和miRNAs，并通过负调控关联分析筛选到了可能参与家蚕抗BmNPV的miRNAs及其可能的靶基因，并进一步研究了miR-3351和miR-6498-5p参与调控BmNPV增殖的机制。主要研究结果如下： 1．不同抗性家蚕感染BmNPV后中肠mRNA-miRNA表达谱分析 通过转录组测序技术对两个家蚕品系感染 BmNPV 后中肠的转录组以及 small RNA 进行了高通量测序，在 A35+_vs._A35-， A35-_vs._P50-， P50+_vs._P50-和A35+_vs._P50+四个比较组中分别筛选到了 119、1231、157、1255个 DE mRNAs和3、82、1、77个 DE miRNAs。通过 GO富集分析，DE mRNAs和 DE miRNAs预测靶基因在生物过程中共同富集到的有代谢过程、细胞过程、生物调控等，在细胞组分共同富集到的有细胞、细胞组分、细胞膜、细胞器等，在分子功能富集到的有结合、催化活性、转运活性等通路。DE mRNAs 和 DE miRNAs 预测靶基因的 KEGG富集分析共同富集到的主要有碳水化合物代谢、信号转导等通路。DE mRNAs 和DE miRNAs 的 RT-qPCR 随机验证结果与 RNA-Seq 结果大致相符。通过负调控关联分析，由于在 A35+_vs._A35-和 P50+_vs._P50-两个比较组中未匹配到负调控对，只在 A35-_vs._P50-和 A35+_vs._P50+两个比较组中获得了 21 个 DE miRNAs 包含 37个DE mRNAs的负调控对。随机挑选了 7对进行了 RT-qPCR验证，均具有相反的表达模式。通过在 BmN细胞中过表达 miRNA检测对应负调控对中预测靶基因的表达变化，最终确定 miR-3351-GSTe6、miR-3343-DJ-1β/IFT172/TMEM132B、miR-2766-5p-CarB和miR-282-5p-ZFP1可能存在负调控关系。 2．miR-3351靶向BmGSTe6调控BmNPV的增殖 miR-3351 和 BmGSTe6 为转录组测序以及负调控关联分析中筛选到的差异表达miRNA-mRNA，通过检测 miR-3351和 BmGSTe6在两个家蚕品系以及家蚕 BmN细胞系中病毒感染后的表达量变化，发现其均响应 BmNPV 的侵染，并且二者表达模式相反；通过双荧光素酶报告系统、RNA 荧光原位杂交和 RNA 结合蛋白免疫沉淀等方法进一步确定 miR-3351靶向 BmGSTe6 并下调其表达；此外分别在细胞水平和蚕体水平通过干扰或过表达 miR-3351和 BmGSTe6检测其对 BmNPV增殖的影响，发现 miR-3351能够抑制 BmNPV的增殖，而 BmGSTe6能够促进 BmNPV增殖；通过干扰或过表达 BmGSTe6 后检测谷胱甘肽转移酶（ GST ）活性的变化，确定BmGSTe6和 GST活性相关，而 GST活性的改变又会引起谷胱甘肽（GSH）含量的变化；最后通过外源添加 GSH 和 GSH 合成抑制剂（BSO）发现 GSH 具有抑制BmNPV增殖的作用，而BSO能够促进BmNPV的增殖。表明miR-3351能够通过靶向BmGSTe6调节GST活性从而调控胞内GSH含量的变化从而参与BmNPV增殖的调控。 3．miR-6498-5p靶向BmPLPP2调控BmNPV的增殖 miR-6498-5p和 BmPLPP2为转录组测序筛选到的差异表达 miRNA和 mRNA，虽然未出现在负调控关联分析结果中，但是有研究发现 miR-6498-5p靶向 BmPLPP2调控家蚕微孢子的增殖。我们通过双荧光素酶报告系统和RNA结合蛋白免疫沉淀等体内外实验进一步确定了 miR-6498-5p靶向负调控 BmPLPP2；在家蚕中肠以及家蚕BmN细胞中发现 miR-6498-5p和 BmPLPP2响应 BmNPV的侵染；分别在细胞水平和蚕体水平通过干扰或过表达发现miR-6498-5p抑制 BmNPV的增殖，而BmPLPP2促进BmNPV的增殖；通过干扰或过表达 BmPLPP2后检测磷酸吡哆醛（PLP）的变化，发现 BmPLPP2 能够作为磷酸吡哆醛磷酸酶调节 PLP 的含量；最后通过外源添加PLP和PLP抑制剂（4DP）发现PLP能够抑制BmNPV的增殖，而4DP能够促进BmNPV的增殖。表明miR-6498-5p能够通过靶向BmPLPP2调节PLP含量的变化从而参与调控BmNPV的增殖。 综上所述，本研究通过转录组测序分析了不同抗性家蚕感染 BmNPV 后中肠mRNA-miRNA表达谱，并通过负调控关联分析缩小了后续筛选靶基因的范围，之后进一步研究了miR-3351通过靶向BmGSTe6以及miR-6498-5p通过靶向BmPLPP2调控 BmNPV 增殖的机制。本研究为家蚕抗 BmNPV 机制研究提供新的线索，也为养蚕业中BmNPV的防治策略提供新的思路。
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