摘要
目的： 近年来，抑郁-肿瘤共病案例日益增多，约30%肿瘤患者患有轻度至重度抑郁症，共患抑郁症的肿瘤患者具有预后差、死亡率高的特点。临床研究表明心理治疗和抗抑郁药可有效缓解抑郁-肿瘤共病患者的抑郁症状，改善患者预后，使患者生存获益。然而，现临床常用的抗抑郁药起效延迟，存在多种不良反应，并不适用于抑郁-肿瘤共病治疗。因此，寻求治疗抑郁-肿瘤共病的有效药物迫在眉睫。四逆散作为“解郁诸方之祖”的经典方剂，基础及临床研究均证实其具有良好的抗抑郁作用。课题组前期研究发现四逆散可改善抑郁-肺癌共病异位荷瘤小鼠的抑郁样行为而发挥抗肿瘤作用，但其作用机制尚未阐明。基于课题组前期研究基础，本研究以肿瘤特殊的代谢方式—有氧糖酵解为切入点，通过慢性应激结合原位荷瘤方法构建抑郁-肿瘤共病小鼠模型，给予中药复方四逆散干预，解析四逆散是否通过调控有氧糖酵解发挥抗抑郁-肿瘤共病的作用及其潜在机制，为中药复方治疗抑郁-肿瘤共病的机制研究和临床应用提供科学依据。 方法： （一）抑郁-肿瘤共病模型小鼠的建立及评价 ①抑郁-乳腺癌共病模型小鼠：6 周龄雌性 BALB/c 小鼠 32 只，随机分为正常组和抑郁组。抑郁组小鼠进行 56 天的慢性不可预知性温和应激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）造模，应激源包括：禁食、禁水、夹尾、束缚、冰水浴、空瓶子、拥挤饲养、潮湿垫料、鼠笼倾斜和昼夜颠倒。CUMS造模成功后，小鼠重新分组，进行乳腺癌原位荷瘤造模。未接受慢性应激的小鼠分为正常组和乳腺癌组（Breast cancer， BC），接受慢性应激的小鼠分为 CUMS 组和抑郁-乳腺癌共病组（Breast cancer-related depression，BCRD）。BC组、BCRD组小鼠右侧皮下乳腺脂肪垫注射5×105个/只4T1-Luc小鼠乳腺癌细胞，其余组注射等体积生理盐水。自接种次日起，BC 组、BCRD 组小鼠每日测量、记录小鼠肿瘤体积与体重。每周采用小动物活体成像技术监测BC组、BCRD组小鼠体内乳腺癌发生发展情况。 ②抑郁-肺癌共病模型小鼠：6 周龄雄性 C57BL/6 小鼠 32 只，随机分为正常组和抑郁组，抑郁组小鼠进行56天的慢性不可预知性温和应激造模，应激源包括：禁食、禁水、夹尾、束缚、冰水浴、空瓶子、拥挤饲养、潮湿垫料、鼠笼倾斜和昼夜颠倒。CUMS造模成功后，小鼠重新分组，并进行肺癌原位荷瘤造模。未接受慢性应激的小鼠分为正常组和肺癌组（Lung cancer，LC），接受慢性应激的小鼠分为 CUMS 组和抑郁-肺癌共病组（Lung cancer-related depression，LCRD）。LC 组、LCRD 组小鼠尾静脉注射1×106个/只Lewis-Luc小鼠肺癌细胞，其余组注射等体积生理盐水。每日测量、记录各组小鼠体重。每周采用小动物活体成像技术监测LC组、LCRD组小鼠体内肺癌发生发展情况。 ③所有小鼠在第八周（CUMS 造模后）和第十三周（荷瘤造模后）进行小鼠行为学实验，包括糖水偏好实验、旷场实验、Y迷宫实验、高架十字迷宫实验、悬尾实验和强迫游泳实验，综合评价各组小鼠的抑郁状态。 （二）抑郁促进小鼠肿瘤发生发展及机制研究 ① 第十三周行为学测试结束后，无痛处死各组小鼠，分离肿瘤和主要脏器并称重；肿瘤、脑、肺脏及肝脏组织制备石蜡切片，HE 染色观察各组织病理形态变化；尼氏染色观察大脑神经元尼氏小体数量。 ②化学检测试剂盒分别检测脑组织和肿瘤组织中有氧糖酵解代谢产物：ATP、丙酮酸和乳酸的含量。Western Blot 方法检测大脑组织中突触性相关蛋白：突触后致密蛋白-95（Postsynaptic densities-95，PSD-95）、生长相关结合蛋白-43（Growth-associated binding protein 43，GAP-43）和突触素（Synaptophysin，Syn）；大脑及肿瘤组织中糖酵解相关限速酶：己糖激酶 Ⅰ（Hexokinase Ⅰ，HKⅠ）、己糖激酶 Ⅱ（Hexokinase Ⅱ，HKⅡ）、磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase platelet type，PFKP）、M2 型丙酮酸激酶（Pyruvate kinase isozyme type M2，PKM2）、丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase A，LDHA）。免疫组化方法检测肿瘤组织中 HKⅡ原位表达情况。 （三）四逆散抗抑郁-肺癌共病的作用及机制研究 ① 6 周龄雄性 C57BL/6 小鼠分为：正常组（生理盐水，灌胃）、LC 组（生理盐水，腹腔注射）、LC+顺铂组（DDP，2mg/kg，腹腔注射）、LC+SNS-L组（四逆散水煎液4.9g/kg，灌胃）、LC +SNS-H 组（四逆散水煎液 19.6g/kg，灌胃），以上各组小鼠不接受 CUMS 刺激，仅进行肺癌荷瘤造模；接受慢性应激的小鼠分为：CUMS组（生理盐水，灌胃）、CUMS+氟西汀组（FXT，5mg/kg，灌胃）、LCRD组（生理盐水，腹腔注射）、LCRD+氟西汀组（FXT，5mg/kg，灌胃）、LCRD+SNS-L组（四逆散水煎液 4.9g/kg，灌胃）、LCRD+SNS-H 组（四逆散水煎液 19.6g/kg，灌胃），以上各组小鼠按前文方法进行抑郁-肺癌共病造模。各组小鼠按相应方式给予相应药物，给药时间共9周。 ② 每日测量、记录各组小鼠体重；每周采用小动物活体成像技术监测小鼠体内肺癌发生发展情况。抑郁-肺癌共病模型小鼠造模结束与给药结束后，对所有小鼠进行糖水偏好实验、旷场实验、Y迷宫实验和高架十字迷宫实验，综合评价各组小鼠的抑郁状态。 ③ 第十五周行为学测试结束后，无痛处死各组小鼠，分离肿瘤和主要脏器并称重；肿瘤和脑组织制备石蜡切片，HE 染色观察各组织病理形态变化；尼氏染色观察大脑神经元尼氏小体数量。化学检测试剂盒分别检测脑和肿瘤组织中有氧糖酵解代谢产物含量（ATP、丙酮酸和乳酸）。Western Blot 方法检测大脑组织中突触性相关蛋白（PSD-95、GAP-43和Syn）；大脑及肿瘤组织中糖酵解相关限速酶（HKI、HKⅡ、PKM2、PDH 和 LDHA）。免疫组化法检测肺部结节组织和非结节组织中 HKⅡ 的原位表达情况。多重荧光染色进行HKⅡ与巨噬细胞标记F4/80、T细胞标记CD3共定位。 结果： （一）抑郁-肿瘤共病模型小鼠的成功建立 与正常组相比，接受CUMS 的两种小鼠糖水偏好率显著降低（p＜0.01）、旷场运动总距离显著减少（ p＜0.01 ）、悬尾实验和强迫游泳实验中静止不动时间显著增加（p＜0.01）、体重减轻（p＜0.01），提示小鼠出现抑郁样行为；接种 9 天后，BC 组和BCRD组小鼠右侧乳腺脂肪垫均检测到4T1-Luc细胞中的蓝色荧光，提示抑郁-乳腺癌共病模型小鼠的成功建立；接种 35 天后， LC 组和 LCRD 组小鼠肺部均检测到Lewis-Luc细胞中的蓝色荧光，提示抑郁-肺癌共病模型小鼠的成功建立。 （二）肿瘤诱导并加重小鼠的抑郁样行为 与正常组相比，BC组小鼠的糖水偏好率显著降低（p＜0.01）、悬尾实验中静止不动时间增加（p＜0.01）、Y迷宫实验中小鼠自发交替次数减少（p＜0.05）；LC组小鼠糖水偏好率显著降低（p＜0.01）旷场运动总距离显著减少（p＜0.01）、小鼠进入开臂次数和停留时间显著减少（p＜0.01），提示肿瘤组（BC组、LC组）小鼠出现抑郁样行为；且小鼠荷瘤前后的两次行为学结果对比分析发现，BC 组与 BCRD 组小鼠、LC 组及LCRD组小鼠的抑郁样行为均比荷瘤前有所加重，且有统计性差异（p＜0.01）；与正常组相比，BC组与BCRD组小鼠、LC组及LCRD组小鼠海马区神经元细胞排列疏松、尼氏小体数量减少，PSD-95、Syn、GAP-43蛋白表达水平呈现降低的趋势。以上结果提示肿瘤可诱导并加重小鼠抑郁样行为。 （三）抑郁促进小鼠肿瘤发生发展和有氧糖酵解 （四）四逆散改善抑郁-肺癌共病模型小鼠抑郁样行为 （五）四逆散抑制抑郁-肺癌共病模型小鼠肿瘤发生发展 （六）四逆散干预肿瘤有氧糖酵解而抗抑郁-肺癌共病 （七）四逆散促进抑郁-肺癌共病模型小鼠肿瘤组织中免疫细胞浸润 结论： 1．抑郁增强肿瘤组织中有氧糖酵解从而促进肿瘤发生发展。 2．四逆散改善抑郁-肺癌共病模型小鼠的抑郁样行为并抑制肿瘤发生发展，对单纯荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用较弱。 3．四逆散抑制肿瘤组织中有氧糖酵解，促进巨噬细胞和T淋巴细胞浸润而抗抑郁-肺癌共病。
NETL