摘要
【目的】 1.明确ABI3在小胶质细胞中高丰度表达，探究ABI3在C57/BL6小鼠与APP/PS1小鼠大脑中小胶质细胞表达的区别。 2.探究ABI3及ABI3S209F对体外小胶质细胞系迁移及吞噬功能的影响。 3.探究ABI3及ABI3S209F能否在细胞内发生液-液相分离(Liquid-Liquid Phase Separation，LLPS)。 4.探究ABI3蛋白的Ser209磷酸化位点及其不同内在无序序列(intrinsically disordered region ， IDR )和不同结构域缺失对ABI3LLPS的影响。 5.探究ABI3及ABI3S209F能否在体外不同条件下发生LLPS。 6.探究海马区小胶质细胞特异性过表达ABI3及ABI3S209F对5×FAD小鼠认知功能及小胶质细胞功能的不同影响，并确定两组5×FAD小鼠海马区是否存在ABI3及ABI3S209FLLPS液滴。 7.探究海马区小胶质细胞特异性敲减ABI3对APP/PS1小鼠认知功能及小胶质细胞功能的影响。 【方法】 1.通过免疫荧光检测ABI3在C57/BL6小鼠大脑中不同神经细胞(神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞)中的表达与定位，通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测C57/BL6WT野生小鼠和APP/PS1小鼠大脑内ABI3mRNA的表达。通过免疫荧光比较ABI3在C57/BL6小鼠和APP/PS1小鼠大脑中小胶质细胞的表达和定位的不同。 2.通过划痕实验胞内评估过表达ABI3及ABI3S209F对小胶质细胞系(HMC3)迁移的影响，通过FAM-Aβ42吞噬实验、YG荧光微球吞噬实验及荧光红乳胶珠摄取实验分别检测过表达ABI3及ABI3S209F对小胶质细胞系(HMC3)吞噬的影响。 3.通过免疫荧光染色检测内源性ABI3在HEK293T细胞及原代小胶质细胞中形成LLPS液滴的能力；通过激光共聚焦成像比较过表达ABI3或ABI3S209F后形成的LLPS液滴的数量、直径、面积等性质的差异，通过光漂白荧光恢复实验(FRAP)、融合-分离实验、光激活optoDroplet等实验方法探究过表达ABI3或ABI3S209F对胞内LLPS形成的液滴差异及液滴动力学的影响。 4.通过激光共聚焦成像比较拟磷取代ABI3S209D、ABI3S209A及不同IDR和不同结构域缺失对ABI3LLPS液滴的数量、直径、面积等性质的差异。通过激光共聚焦成像比较连接FUSIDR的ABI3S209F的质粒、连接FUSIDR的ABI3关键IDR缺失的质粒或连接FUSIDR关键结构域缺失的质粒过表达对LLPS液滴的数量、直径、面积等性质的差异。 5.在大肠杆菌中表达纯化带有GFP标记的pET28a-MBP-ABI3-GFP、pET28a-MBP-ABI3S209F-GFP重组蛋白，通过浊度实验、FRAP、液滴融合-分离、激光共聚焦成像比较体外不同NaCl浓度及不同的大分子拥挤剂不同条件下ABI3-GFP及ABI3S209F-GFP重组蛋白LLPS液滴形成的差异及液滴转变为纤维状聚集体的能力。 6.通过旷场实验、Y迷宫、新物体识别、水迷宫等行为学实验比较小胶质细胞特异性过表达ABI3和ABI3S209F对5×FAD小鼠认知功能的影响；通过qRT-PCR、免疫荧光等实验分析ABI3或ABI3S209F小胶质细胞特异过表达对小胶质细胞功能、Aβ分子病理的影响，共聚焦观察海马区ABI3及ABI3S209FLLPS液滴。 【结果】 1.qPCR实验显示与C57/BL6小鼠相比，ABI3mRNA在APP/PS1小鼠皮层组织(P＜0.05)和海马组织(P＜0.001)的表达明显增多。免疫荧光结果显示ABI3主要在小胶质细胞表达，在APP/PS1小鼠大脑中的表达明显增多。 2.划痕实验结果显示与Vector对照组或Vector+Aβ对照组相比，随时间增加ABI3过表达组(P＜0.05)和ABI3+Aβ组(P＜0.0001)的HMC3细胞的伤口愈合率明显增加；与ABI3过表达组相比，ABI3S209F过表达组(P＜0.05)和ABI3S209F+Aβ组的HMC3细胞的伤口愈合率(P＜0.0001)则明显下降；与ABI3+Aβ组相比，ABI3S209F+Aβ组的HMC3细胞的相对伤口密度则明显下降(P＜0.0001)。ABI3S209F过表达组的小胶质细胞系(HMC3)伤口融合度(P＜0.01)和相对伤口密度(P＜0.05)均明显下降(P＜0.05)。FAM-Aβ42吞噬实验、YG荧光微球吞噬实验及荧光红乳胶珠摄取实验均证实，与Vector对照组相比，ABI3过表达组的HMC3细胞吞噬的FAM-Aβ42(P＜0.05)、YG荧光微球(P＜0.05)及荧光红乳胶珠数量(P＜0.05)明显增多，与ABI3过表达组相比，ABI3S209F过表达组的HMC3细胞吞噬的FAM-Aβ42(P＜0.05)、YG荧光微球(P＜0.001)及荧光红乳胶珠(P＜0.01)数量的数量则明显减少。 3.与ABI3过表达组形成的ABI3LLPS液滴相比，ABI3S209F过表达组形成的ABI3S209FLLPS液滴数量明显增多(P＜0.0001)，但是液滴直径(P＜0.01)和面积(P＜0.05)则明显减少。1，6-己二醇能够破坏ABI3和ABI3S209F形成的液滴状凝聚物。ABI3和ABI3S209F形成的LLPS液滴可以相互融合和分离，光漂白后ABI3S209F蛋白液滴的相对荧光值恢复地比ABI3蛋白液滴更快，蓝光照射后能够诱导ABI3-IDR-mCherry-Cry2融合蛋白的聚集。 4.与ABI3过表达组相比，ABI3S209D过表达组液滴的数量明显减少(P＜0.05)，直径(P＜0.0001)则明显增大；ABI3S209A过表达组液滴的数量(P＜0.001)明显增多，面积(P＜0.0001)明显减小。ABI3?161-302(?IDR2)组细胞中几乎没有液滴的形成(P＜0.0001)，ABI3S209F?215-302(?IDR3)-EGFP组LLPS液滴的直径和面积最大。ABI3?Abidomain液滴数量(P＜0.0001)、直径(P＜0.0001)和面积(P＜0.0001)均明显减少。与ABI3S209F相比，ABI3S209F-FUSIDR(3-254)LLPS液滴的数量(P＜0.05)明显增多，直径(P＜0.0001)和面积(P＜0.0001)均明显增大。 5.体外纯化的ABI3和ABI3S209F蛋白可独立发生LLPS形成液滴状凝聚物，浊度实验证实ABI3和ABI3S209F在体外大分子拥挤剂PEG条件下可发生相分离，加入1,6-己二醇ABI3和ABI3S209FLLPS液滴明显溶解。在相同重组蛋白浓度和NaCl浓度条件下或相同浓度PEG‐8000或Ficol-400条件下，与ABI3相比，对应浓度的ABI3S209F重组蛋白形成液滴的能力均减弱，但在高浓度条件下或随时间增加ABI3S209F液滴更易转变成胶状或纤维；光漂白后ABI3液滴和ABI3S209F液滴均可恢复荧光，但是ABI3S209F液滴荧光恢复地更快。 6.旷场实验显示各组小鼠的自发运动能力正常，Y迷宫实验证实与5×FAD+Ctrl小鼠相比，5×FAD+ABI3小鼠的自发交替率明显增高(P＜0.05)；与5×FAD+ABI3小鼠相比，5×FAD+ABI3S209F小鼠自发交替率则明显降低(P＜0.01)。Y-迷宫新奇臂发现5×FAD+Ctrl小鼠相比，5×FAD+ABI3小鼠进入新奇臂的次数和百分比均明显增多(P＜0.05)；与WT+Ctrl相比，5×FAD+ABI3S209F小鼠进入熟悉臂的百分比则明显增多(P＜0.05)。新物体识别结果则显示各组小鼠对新物体的识别能力没有显著差异。 【结论】 1.ABI3在小胶质细胞中高丰度表达，在APP/PS1小鼠的小胶质细胞中表达明显增多。 2.ABI3过表达促进体外小胶质细胞系的迁移和吞噬，ABI3S209F过表达抑制体外小胶质细胞系的迁移和吞噬。 3.ABI3和ABI3S209F蛋白均能在胞内发生LLPS，与ABI3蛋白相比，ABI3S209F蛋白的相分离能力相对较弱。 4.ABI3S209DLLPS的能力增强，ABI3IDR2[161-302]和ABI3-Abidomain分别是决定ABI3蛋白LLPS能力的关键IDR和关键结构域。连接FUSIDR的ABI3S209F能够逆转ABI3S209F液滴的数量、直径和面积，增强ABI3S209FLLPS的能力。 5.ABI3和ABI3S209F均能在体外不同条件下发生LLPS，与ABI3蛋白相比，ABI3S209F蛋白形成液滴的能力明显减弱，但随时间和浓度增加其更易形成胶状或纤维状结构。 6.过表达小胶质细胞特异性ABI3小胶质细胞特异性ABI3过表达的5×FAD小鼠可减轻5×FAD小鼠的认知障碍，并且抑制淀粉样蛋白β(Aβ)的积累，促进Aβ斑块周围相关小胶质细胞的聚集。 7.海马区小胶质细胞特异性ABI3敲低对APP/PS1Tg小鼠认知能力基本没有影响，但能够促进Aβ的积累，抑制Aβ斑块周围相关小胶质细胞的聚集。
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