摘要
【目的】 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球高发病率和高死亡率的消化道恶性肿瘤之一。本研究基于数据挖掘技术，以肿瘤微环境为核心，分别从铁死亡、衰老以及药物靶标等三个方面探索 CRC 肿瘤微环境（ tumor microenvironment, TME）相关的生物标志物，为CRC的精准诊疗提供新的途径。 【方法】 1. 铁死亡与TME相关的标志物筛选：在GEO和TCGA数据库中获取CRC 的转录组数据，分析铁死亡修饰模式与 TME 细胞浸润特征的对应关系，基于铁死亡修饰模式分析得到铁死亡相关的生物标志物并构建评分系统。在结直肠癌细胞中分析潜在标志物载脂蛋白 L6 （ apolipoprotein L6, APOL6）对铁死亡的调节机制以及运用单细胞测序技术（single cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析APOL6的免疫细胞景观和细胞通讯。 2. 衰老与TME相关的标志物筛选：从GEO数据库中获取CRC单细胞数据，识别衰老相关的免疫细胞和基质细胞亚群。使用SCENIC、KEGG富集和细胞通讯等方法对免疫细胞亚群进行综合分析，筛选各亚群的衰老相关标志物，并进一步分析标志物表达与CRC预后和免疫治疗反应性之间的关系。在80名CRC患者组织样本中验证生物标志物（IGFBP2、CXCL2和VEGFA）的表达。 3. 药物靶标与TME相关的标志物筛选：从TCGA数据库中获取CRC转录组数据，基于CRC样本的免疫浸润景观进行无监督聚类分析。并通过GSVA算法和ssGSEA方法分析CRC样本的生物途径变化及其免疫细胞的相对丰度以鉴定出其中的免疫炎症型患者（immune inflammatory patients, IIP）。然后利用ESTIMATE算法鉴定出IIP的TME相关基因。结合数据挖掘和网络药理学分析技术筛选出薏仁附子败酱散（Yi-Yi-Fu-Zi-Bai-jiang San, YYFZBJS）对IIP型CRC患者的潜在靶标，并构建独特的“中药-活性成分-靶点”调控网络。最后，使用LASSO-COX分析YYFZBJS在IIP型CRC患者TME中的核心标志物，构建预后风险预测模型并探索潜在标志物的作用机制。 【结果】 1. 鉴定出CRC的TME中三种铁死亡修饰模式（抗氧化防御、铁毒性和脂质过氧化），模式对应于CRC三种免疫表型（免疫排斥、免疫沙漠和免疫炎症），识别出特征基因（GPX4、TFRC和DPP4）。通过847个铁死亡修饰模式相关差异表达基因鉴定出22个预后标志物，并确定APOL6是TME中铁死亡相关的关键标志物。构建的FRG评分系统可预测免疫治疗临床效益与预后。体外实验中，敲低APOL6可下调DPP4，上调TFRC，进而细胞分泌MDA和GSSG降低，促进GSH、GSH/GSSG比值及氧化应激水平的升高。进一步的单细胞分析表明，APOL6在CRC的T细胞亚群中显著富集，14个特异性免疫激活基因在APOL6+CD8 T细胞中上调。细胞通讯分析表明，APOL6+CD8 T细胞与上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞密切相关。 2. 衰老细胞亚群在CRC的TME中显著富集，包括成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞亚群，筛选出上调的免疫衰老相关基因（C3、CCL13、SPP1和NAP1L4等），识别出新的衰老相关TME细胞亚群（IGFBP2+CAF-C3, CXCL2+CAF-C4 和 VEGFA+Mac-C4）和衰老相关标志物（IGFBP2、CXCL2和VEGFA）。预后分析表明抑制这些细胞亚群上衰老标志物的表达可能改善患者预后。同时，IGFBP3+CAF-C1、C3+CAF-C2、IGFBP2+CAF-C3等亚群与免疫治疗耐药性有关，而它们介导的细胞互作通讯的增强可促进TME中肿瘤血管系统和免疫抑制。 3. 在480名结直肠癌患者中，鉴定出284名IIP型患者。本研究共筛选出 35 个 YYFZBJS 治疗 IIP 型 CRC 患者的潜在靶标，并构建 LASSO-COX预后预测模型，鉴定出11个预后标志物（HPGDS、PIK3CG、C5AR1、PRF1、CAV1、PTGS2、SERPINE1、IDO1、TGFB1、CXCR2和MMP9）。这些基因在IL-17信号通路、花生四烯酸代谢等途径中显著富集。单细胞分析证实这些预后基因的异常表达与结直肠癌的TME有关。 【结论】 1. 本研究基于铁死亡修饰模式与TME的免疫景观，鉴定出与TME相关的铁死亡生物标志物，并验证了APOL6与CRC的铁死亡和TME的相关性，对进一步探索CRC患者中的铁死亡机制具有参考价值。 2. 本研究揭示了新定义的与衰老和 TME 相关的细胞亚群及其生物标志物，对在单细胞水平上理解CRC患者的免疫衰老机制和免疫治疗应答具有指导意义。 3. 本研究从薏仁附子败酱散的药物靶标中鉴定出IIP型CRC患者的生物标志物，并揭示了其物质基础和作用机制，为IIP型CRC患者的临床治疗和药物发现提供了新视角。
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