摘要
研究目的： 当皮肤因外伤、手术、慢性疾病等原因导致完整性破坏时，其功能被损坏并形成皮肤创伤。较小的皮肤创伤可以通过机体自愈能力进行修复，但损伤面积过大或同时合并感染、糖尿病等基础疾病时，皮肤的自愈能力被破坏将形成难以愈合的慢性皮肤创伤，此时往往需要额外的手段进行干预治疗以加快皮肤组织愈合速率。临床上最常使用的创伤敷料(纱布、创可贴、脱脂棉等)保湿性差，缺少抗感染能力，容易与皮肤创口粘连造成二次损伤。近年来，由于水凝胶具有良好的保水性、类细胞外基质的三维结构及操作的简便性被越来越多的应用于创伤敷料的研发中。为了解决由于细菌感染导致的难愈合创口的修复，本研究将以甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)、MXene(Ti2C3)和新型抗菌肽(V-Os)为材料制备一种具备抗细菌感染和促创伤修复的水凝胶敷料，并同时联合电刺激(Electrical Stimulation：ES)增强水凝胶的修复效果。 研究方法： 1.采用多肽合成技术在抗菌肽Os的N端加入胶原特异黏附序列，制备能够和GelMA特异黏附的抗菌肽(V-Os),使用荧光成像法检测V-Os与普通抗菌肽Os与GelMA的特异结合能力的差别。研究不同浓度的抗菌肽V-Os的抑菌效果，寻找抗菌肽V-Os的最佳使用浓度。 2.对水凝胶材料和其中的组分进行傅里叶红外光谱((FourierTransforminfraredspectroscopy，FTIR)、透射电镜(TransmissionElectronMicroscope，TEM)、X射线光电子能谱(X-ray Photoelectron Spectroscopy，XPS)、扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy，SEM)、MicroCT、水接触角(Water Contact Angle，WCA)、电导率、力学性能等理化指标进行表征。 3.对不同组别的水凝胶敷料进行体内和体外的抑菌能力测定。对不同组别水凝胶上生长的细胞施加不同电压(0-400mv)的电刺激信号，研究促进细胞增殖的最佳电刺激条件。使用免疫荧光染色和qPCR技术研究不同组别敷料上生长细胞的COL-I和VEGF在蛋白水平和基因水平的表达变化。 4.使用大鼠全皮层损伤模型评估不同组别创伤敷料在0-11天内的修复效果，计算不同时间点的伤口愈合率。对伤口位置进行HE、Masson和天狼猩红染色，评估不同组别敷料对伤口的修复效果。对伤口位置进行CD31和TNF-α免疫荧光染色评估重建伤口位置的血管生成和抗感染情况。对动物内脏进行HE染色评估敷料的安全性。 5.使用转录组学分析方法研究敷料中Ti2C3和电刺激信号在修复创伤过程中可能参与调控的细胞信号转导通路，从分子水平揭示本研究制备的伤口敷料的潜在作用机制。 研究结果： 1.GelMA与抗菌肽结合实验结果显示，胶原特异黏附序列的引入能够显著提高抗菌肽V-Os和GelMA的结合能力。250μg/mL浓度的抗菌肽抑菌能力达到80%以上，被优化选择为抗菌肽在水凝胶中的添加浓度。 2.FTIR和XPS结果显示我们制备的水凝胶中成功的掺入了Ti2C3和抗菌肽V-Os组分，并且未发生分子结构上的变化。TEM结果显示Ti2C3呈现片层结构，水凝胶在405nm光照射下能迅速固化，水凝胶孔隙率在89.10-89.79%之间。 3.水凝胶中加入Ti2C3后能够显著增强材料的拉伸强度，同时也能够显著增强材料的导电能力。水凝胶含有V-Os组的材料能够有效的抑制细菌生长和增强组织的抗感染能力。 4.细胞增殖实验结果显示200mv/cm的电刺激条件最有利于细胞的增殖。免疫荧光结果和qPCR结果显示Ti2C3的加入能够明显增强细胞COL-I和VEGF的表达。当同时施加电刺激后，这种增强效果变的更为显著。 5.大鼠全皮层伤口修复结果显示，水凝胶中含有Ti2C3和V-Os并同时施加电刺激组(GelMA@Ti2C3/V-Os-ES)对伤口的修复效果最好，在第11天时，伤口愈合率达到94.41±1.95%。组化结果也显示GelMA@Ti2C3/V-Os-ES组的胶原沉积效果最佳，重建的表皮最为光滑平整，胶原中COI-I的含量最高。所以组的动物均具有较高的生物安全性，未发现明显的脏器毒性。 6.通过分析转录组学GelMA@Ti2C3/V-Os-ES和GelMA@V-Os组上生长的细胞的差异表达基因，我们发现GelMA@Ti2C3/V-Os-ES组中有CDK1、MCM5和CDC20基因被上调表达，CDK1、MCM5和CDC20基因在调控细胞增殖方向发挥重要作用。同时也发现Casp12被下调表达，Casp12在调控细胞凋亡领域发挥重要作用，因此我们初步探索了Ti2C3和ES在调控伤口修复领域可能的分子机制。 研究结论： 本研究通过同时负载Ti2C3及V-Os制备一种多功能水凝胶敷料材料，同时结合电刺激治疗协同提升皮肤组织愈合速率。Ti2C3及V-Os有效增强了水凝胶材料的导电性、抗菌性、机械强度等多种理化性能，有效促进了细胞的增殖、黏附及组织修复相关基因表达。结合电刺激治疗后，GelMA@Ti2C3/V-Os水凝胶能够加速大鼠背部全皮层伤口的愈合。同时，我们使用转录组学分析方法初步探究了Ti2C3材料和电刺激在伤口修复过程中所涉及的分子机制。因此，这种多功能伤口修复水凝胶复合材料联合电刺激的治疗体系在皮肤伤口修复的临床治疗中具有很大的应用前景。
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