摘要
草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)是世界重要迁飞性害虫，大爆发对农作物生产造成巨大威胁。成虫繁殖力强，能多次交配，单头雌虫产卵数量可达数百至上千粒，后代数量庞大且存活率高。piRNAs可引导PIWI蛋白靶向细胞中的转座子，从而抑制转座子活性以调控昆虫的生殖，筛选靶向昆虫生殖的分子靶标也成为害虫防治研究的热点。目前，已有研究报道piRNA合成通路中的Siwi基因参与家蚕的生殖调控。CRISPR-Cas9是一种操作简单且有效的基因编辑技术，具有高效率编辑、脱靶率低等优点，在模式生物和非模式生物中进行基因编辑和基因功能探究具有巨大的潜力。因此，本研究利用CRISPR-Cas9技术对草地贪夜蛾Siwi基因进行功能研究，探究Siwi基因对草地贪夜蛾繁殖力的影响，为开发新的害虫防治分子靶标提供理论依据和新思路。本研究的主要结果如下： 1.草地贪夜蛾Siwi基因克隆与序列分析 从草地贪夜蛾中鉴定克隆获得Siwi基因全长并进行生物信息学分析，得出Siwi基因氨基酸数目为916aa，分子量大小为104317.79D，等电点为9.78pI，不稳定系数为45.73，疏水性指数为-0.516。分析草地贪夜蛾Siwi基因蛋白质二级结构可知，α-螺旋为31.66%，延伸链为19.98%，β-转角为3.60%，无规则卷曲为44.76%。我们得到草地贪夜蛾Siwi基因有PAZ_piwi_like和Piwi_piwi-like_Euk两个结构域，又通过SWISS-MODEL得到草地贪夜蛾Siwi基因的蛋白质三级结构。构建系统发育树分析发现，草地贪夜蛾Siwi基因和鳞翅目昆虫聚成一个分支，亲缘关系相近。 2.草地贪夜蛾Siwi基因时空表达模式分析 草地贪夜蛾Siwi基因在转录水平上的时空表达模式分析结果表明，该基因在草地贪夜蛾的不同发育时期表达模式分析中预蛹期表达量最高，其次在雌性成虫和雌性蛹中表达量较高，在1-6龄幼虫期、雄性蛹和雄性成虫表达量显著低于其他组。在2日龄成虫的不同组织表达模式分析发现，Siwi基因在2日龄雌性卵巢中特异性表达，显著高于其他组织，说明草地贪夜蛾Siwi基因可能与生殖方面有关。 3.草地贪夜蛾Siwi基因敲除后的突变检测和表型鉴定 将注射的部分卵提取基因组DNA并进行PCR扩增送测，由测序结果可知，与野生型相比，注射的卵峰图杂乱且出现碱基突变，说明成功产生突变。随后对样品又再次进行检测，得到4种突变类型，表现为插入或缺失，说明可能会出现表型不同的突变体。通过对敲除后草地贪夜蛾蛹的蛹腹部外观、蛹长、蛹宽、蛹重、产卵量、卵孵化率及精卵巢比较分析发现，雌雄蛹腹部第一和第二体均出现足形态退化异常；突变体雌雄蛹的蛹长、蛹宽显著变短，蛹重显著降低；突变体的精巢围巢膜上出现颜色异常，而突变体的卵巢一侧出现缩小现象，更严重则不能正常发育。 4.草地贪夜蛾Siwi基因敲除后生殖力测定 突变体与野生型雄性和野生型雌性交配后的产卵量显著降低，突变体雌性与野生型雄性的卵孵化率也显著下降，大部分不能正常孵化。表明敲除Siwi基因会对草地贪夜蛾的生殖造成影响，后代数量和存活率大大降低。 综上所述，草地贪夜蛾Siwi基因突变品系在蛹期和成虫时期都出现了明显的变化，对草地贪夜蛾的繁殖能力造成显著影响，说明Siwi基因在草地贪夜蛾生殖调控方面发挥重要功能，这为草地贪夜蛾的绿色防控提供了潜在防治靶标和新思路。
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