摘要
糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR)是一种严重的糖尿病并发症，可导致失明，DR已成为工作年龄人群失明的主要原因之一，严重的危害了人民群众的眼健康。氧化应激可导致线粒体损伤、炎症、视网膜内皮功能失调等，已被证实是参与DR 发病机制的关键因素。组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylase, HDAC）是一类蛋白酶，可通过调控组蛋白的乙酰化来调节基因的表达。在DR发病过程中，HDACs 可影响氧化应激和炎症反应的发生，从而影响 视网膜血管功能。研究表明，HDAC7在氧化应激、新生血管生成中均扮演重要角色，但其在 DR 发生发展中的作用尚不明确。此外，抗氧化蛋白 NRF2 和 SOD2在高糖环境中的视网膜血管内皮细胞中表达显著降低，与视网膜氧化应激密切相关。因此，探索糖尿病环境中HDACs在视网膜氧化应激中的作用及其相关调控机制，对于进一步研究DR中氧化应激的分子机制，以及探索对DR的早期防治措施具有重要潜在价值。 【目的】 本研究旨在探讨高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞（Human Retinal Microvascular Endothelial Cells，HRMECs）中 HDAC7 和氧化应激相关标志物 NRF2和SOD2的变化及调控关系，以及HDAC7的泛素化调控机制，为DR发病机制研究和寻找新的DR治疗靶点提供理论依据。 【方法】 利用 Western blot 法筛选出在高糖处理的 HRMECs 中异常表达的 HDACs；用活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）荧光探针法和 JC-1 染色法检测氧化应激水平；用RNA干涉技术及慢病毒感染HRMEC细胞，构建HDAC7敲减的细胞系；用Western blot 实验观察各氧化应激相关标志蛋白的表达情况，筛选出差异蛋白进行进一步研究；Western blot 实验检测高糖模型下 HDAC7 敲减 HRMECs 中 NRF2 和 SOD2 的表达；Western blot 实验检测加入 NRF2 激动剂TBHQ后NRF2、SOD2和 HDAC7 的表达情况；用 ROS 荧光探针法和 JC-1 染色法检测氧化应激水平；用 MG132 和氯喹（Chloroquine, CQ）分别处理 HRMECs，Western blot 实验观察 HDAC7 的表达情况；免疫共沉淀法（Co-inmunoprecipitation, Co-ip）检测与HDAC7结合的接头蛋白（Cullins, CULs）；RNA干涉技术及慢病毒感染HRMEC细胞，构建CUL2敲减的细胞系，用Western blot 实验观察各蛋白的表达情况；构建 HA-HDAC7、Myc-CUL2 和泛素（Ubiquitin, Ub）的过表达质粒，转染 HRMECs，Ni-NTA His-Tag 泛素化水平测定实验观察HDAC7的泛素化水平。 【结果】 1. ROS 染色结果显示，高糖处理能显著增加 HRMECs 细胞内 ROS 的积累，而 JC-1 染色结果显示，高糖处理能显著降低 HRMECs 线粒体功能。 2. 在高糖处理后，HRMEC 中 HDAC2、7、9 的呈高表达，其中 HDAC7 表达升高更为显著。 3. Western blot 结果显示，在 mRNA 水平敲减 HDAC7 后，HRMECs 的 NRF2和SOD2蛋白表达增高；同时，HDAC7敲减能够部分逆转高糖介导的HRMECs中NRF2和SOD2蛋白表达降低。梯度加入NRF2激动剂TBHQ后，能够促进SOD2的蛋白表达，但对HDAC7的蛋白表达无明显作用。ROS荧光探针法和JC-1染色结果显示，HDAC7敲减能够部分逆转高糖介导的HRMECs细胞内ROS水平升高以及线粒体功能减弱。 4. Western blot 结果显示，在 HRMECs 中蛋白酶体抑制剂 MG132 能显著抑制HDAC7的降解。Co-IP结果显示HRMECs中HDAC7与CUL1和CUL2存在蛋白互作。在mRNA水平敲减CUL1和CUL2后，发现HDAC7在CUL2敲减的细胞系中表达升高，而在CUL1 敲减的细胞系中无明显变化。同时，Ni-NTA His-Tag 泛素化水平测定实验表示CUL2能提升HDAC7的泛素化水平。 【结论】 在我们对DR的研究中，通过体外模拟高血糖的条件来探索高糖环境对视网膜内HRMECs的影响。实验结果表明，高糖处理显著增加了HRMECs中HDAC7的表达，并伴随着ROS水平的升高及线粒体功能的减弱。进一步的研究发现，HDAC7能够抑制关键的抗氧化应激蛋白NRF2和SOD2的表达。我们通过敲减HDAC7来研究其在氧化应激中的作用，并发现HDAC7的敲减可以逆转高糖引起的NRF2和SOD2表达下降，这说明HDAC7参与到了高糖诱导的氧化应激反应中。此外，敲减HDAC7还可以降低由高糖处理引起的ROS水平和线粒体功能损伤。因此，本部分研究结果提示：高糖环境下HDAC7的高表达加剧了氧化应激，并对HRMECs的线粒体功能造成了损害，而敲减HDAC7可以减轻高糖引起的氧化应激。这些发现为DR的治疗策略提供了新视角，特别是在HDAC7以及抗氧化应激蛋白的调节机制方面，为发现新的治疗靶点提供了科学依据。 此外，我们还针对HDAC7蛋白降解的分子机制进行初步探索，结果显示：HDAC7的降解显著的受到蛋白酶体途径的调控。在蛋白酶体途径抑制剂MG132的处理下，HDAC7的降解明显放缓。进一步的共免疫沉淀实验揭示了HDAC7与CUL1和CUL2蛋白之间存在显著相互作用，提示CUL1和CUL2可能参与调控HDAC7的稳定性。我们构建的CUL1和CUL2敲减的HRMECs模型表明，CUL2敲减导致了HDAC7表达的增加。这一结果在随后的实验中得到了进一步的证实，随着CUL2含量的增加，HDAC7的泛素化水平相应提高。综上所述，我们的研究得出结论，CUL2通过促进HDAC7的泛素化来调控其在HRMECs中的稳定性和表达水平，这为HDAC7在DR中的调节路径提供了新见解，并为未来潜在的治疗干预策略提供了有价值的靶标。
NETL