摘要
石榴（Punica granatum L.）属千屈菜科石榴属，因树形优美，常应用于园林绿化。石榴籽粒中富含花青素，花青素是自然界中广泛存在的天然色素，对人体有抗氧化等多种营养保健作用。花青素合成酶（ANS）是花青素合成途径末端的关键酶，在花青素的合成及累积中起重要作用。石榴籽粒的颜色主要有红色和白色两种。 本研究以石榴品种白玉石籽和红玉石籽为试验材料，测定石榴籽粒花后120天总花青素的含量，同时对石榴ANS基因家族进行全基因组鉴定和生物信息学分析，并选择花后40天、80天和120天的石榴籽粒进行转录组测序。基于转录组数据，筛选不同时期的差异表达基因，对差异表达基因进行 GO富集和 KE GG富集分析，根据分析结果挖掘参与石榴籽粒花青素合成途径中的基因，实时荧光定量 PCR对所选基因的表达模式进行验证。本试验分析白玉石籽和红玉石籽果实发育过程中花青素相关基因的表达特性，初步探究石榴籽粒花青素合成的分子机理。主要结果如下： （1）测定花后120天白玉石籽和红玉石籽两个品种籽粒的总花青素含量，结果显示白玉石籽和红玉石籽均能检测到花青素，其中红玉石籽中总花青素含量平均值为1.13 mg/g，白玉石籽中总花青素含量的平均值为 0.80 mg/g，差异显著性分析结果（P=0.0048）表明红玉石籽中总花青素含量显著高于白玉石籽。 （2）在石榴基因组中共鉴定出75个 ANS基因家族成员，不均匀分布在石榴8条染色体中的7条上。石榴ANS蛋白均为亲水性，且均定位在细胞质内。蛋白质二级结构预测表明，无规则卷曲和α-螺旋是石榴ANS蛋白二级结构的主要组成形式。PgANS 基因均含有 1 个 DIOX -N和 1 个 2OG-Fe(Ⅱ)-Oxy 结构域，根据系统进化分为四个组，组内成员之间motif位置及组成高度保守。 （3）利用转录组数据中基因的FPKM值绘制PgANS基因表达热图，在红玉石籽中PgANS58、PgANS9 和 PgANS52 等基因的表达水平随着时期的变化呈现先上升后下降的趋势，在花后80天时表达量最高；PgANS1、PgANS11和PgANS24等基因在花后 40 天时表达量最高，随后表达量降低；PgANS6、PgANS63 和 PgANS4 在花后120天时表达量最高。在白玉石籽中，PgANS42、PgANS29 和 PgANS66 等基因的表达量随着时期变化呈现先上升后下降的趋势，在花后80天的表达量最高；PgANS64、PgANS45和PgANS71在花后40天时的表达量最高；PgANS39、PgANS3和PgANS49等基因在花后120天时的表达量最高。 （4）对两个石榴品种红玉石籽和白玉石籽的转录组测序结果进行分析，筛选差异表达基因，花后80天这一比较组发现2396个差异表达基因，其中在红玉石籽中表达上调的基因1393个，表达下调的基因1003个；花后120天这一比较组发现634个差异表达基因，其中上调基因472个，下调基因162个。 （5）GO富集分析结果显示，花后80天差异表达基因主要富集在催化活性、转氨酶活性和氧化还原酶活性等；花后120天差异表达基因主要富集在膜、膜部分、激酶活性和核酸结合转录因子的活性等。KEGG富集结果显示，花后80天差异表达基因主要富集在代谢途径和次生代谢物的生物合成等代谢通路中，花后120天差异基因主要富集在植物与病原的相互作用、MAPK 信号通路和植物激素信号转导等代谢通路中。 （6）根据GO和KEGG富集分析结果，筛选出6个与石榴花青素合成相关的基因：LOC116194939、LOC116200996、LOC116201797、LOC116208047、LOC116211316和LOC116213234。其中LOC116213234与鉴定出的石榴ANS家族成员PgANS1序列一致，LOC116211316与鉴定出的石榴ANS家族成员PgANS24序列一致。 （7）qRT-PCR 结果表明，在红玉石籽中，LOC116200996 的表达随着时期变化呈现先上升后下降的趋势，在花后 80 天表达量最高；LOC116213234（PgANS1）、LOC116194939、LOC116201797、LOC116208047和LOC116211316（PgANS24）的表达量随着时期变化逐渐增高，在花后 120 天时表达量达到最高。在白玉石籽中， LOC116200996和LOC116213234（PgANS1）的表达量随着时期变化呈现先上升后下降的趋势，在花后80天表达量最高；LOC116194939、LOC116201797、LOC116208047和LOC116211316（PgANS24）的表达水平随时期的变化逐渐上升，在花后120天表达量最高。在花后120天时，所选6个基因的表达量均为红玉石籽中高于白玉石籽，说明所选基因与石榴花青素合成相关。 （8）将PgANS1与其他物种的ANS蛋白序列构建系统发育树并进行序列比对，发现PgANS1与紫薇的亲缘关系最近，其中LiANS1被证明与花青素含量密切相关，说明PgANS1与石榴花青素的含量也密切相关。
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