摘要
石榴（Punica granatum L.）在中国的栽种历史悠久，具有较高的经济价值、生态价值、药用保健价值和文化价值。冷藏是果实贮藏的重要手段，但石榴易受冻害是低温贮藏果实的主要限制因素，严重降低石榴的消费品质和商品价值。茉莉酸甲酯可以抑制石榴果实的冷害和水分流失，保持果实外观，对果实内部品质也没有异常影响。TIFY基因作为茉莉酸信号转导通路上游重要的关键因子，JAZ亚家族通过解除对MYC2及其他转录因子的抑制作用，参与了JA对ICE-CBF/DREB1转录通路的调控，增强对冷害的抵御。本研究首先通过对石榴TIFY基因的生物信息学分析，鉴定并研究了石榴TIFY基因家族的理化性质、进化关系和功能预测分析；然后选取“突尼斯软籽”和“红玉石籽”花后40天、80天、120天的果实，分析石榴TIFY、MYC2-like、ICE1-like及其它相关基因的表达模式；最后下载经过低温（LTC）和冷藏处理的石榴果实、经过外源MeJA处理的石榴叶片的转录组数据，并加以分析，通过RT-qPCR对结果进行验证。主要结果如下： 1）石榴中共鉴定出15个TIFY基因，根据其保守的结构域分别分为TIFY、ZML、JAZ和PPD4个亚家族，分别拥有1个，3个，10个，1个基因。理化信息分析如下：氨基酸长度在126~452之间，分子量14129.02~47043.52 kD之间，蛋白质的理论等电点4.75~10.17之间。该基因家族转录的蛋白大部分为碱性蛋白，除ZML1a和ZML1b外，其余蛋白均为不稳定蛋白。脂肪系数为62.04~82.19为亲水蛋白。随机螺旋占蛋白质的比例最大，其次是Alpha螺旋，Beta旋转最小。亚细胞定位预计主要发生在细胞核中。石榴进化分析如下：15个基因在8条石榴染色体上定位不均匀，在JAZ5和JAZ15，JAZ8和JAZ12中发生了片段重复。比起拟南芥，石榴与巨桉的亲缘关系更为密切，同一亚家族具有相似的基因结构、保守基序和特异性的保守结构域，共线性及进化树分析表明石榴的TIFY基因是高度保守的基因，变异较少，在结构和功能上有很高的相似性。石榴功能预测如下：通过启动子分析，TIFY基因在石榴的生长发育、激素反应和应激反应中起着重要作用，蛋白相互作用分析表明，石榴TIFY家族与一些MYC-like的BHLH蛋白、R2R3-MYB、F-box、NINJA等蛋白相互作用。 2）对果实不同时期的转录组分析中，石榴大多数的TIFY基因随着果实的成熟表达量降低。“突尼斯软籽”的ZML1、PPD11、JAZ4、JAZ5、JAZ8、JAZ15在三个时期呈现连续下降趋势，除ZML2、ZML9、JAZ6、JAZ13之外，剩下的基因都在40到80天时出现明显下调；“红玉石籽”的PPD11、JAZ4、JAZ8、JAZ14和JAZ15的表达量在三个时期也一直呈现下降趋势，JAZ6和JAZ13的表达正好相反，为上升趋势。两个品种的ICE1-like基因的表达都呈现出先降后升的模式。 3）对两种石榴品种的转录组数据进行比较。40天时“突尼斯软籽”的ZML1、ZML2、TIFY3、JAZ6、JAZ15表达水平低于“红玉石籽”，其余TIFY基因都是“突尼斯软籽”高于“红玉石籽”；80天和120天时，JAZ4、JAZ5、JAZ6、JAZ8、JAZ10、JAZ13和JAZ15在“红玉石籽”的表达量更高，ZML2和ZML9在“突尼斯软籽”中的表达量更高。40和80天时，“突尼斯软籽”的ICE1-like表达量更高，120天时“红玉石籽”的ICE1-like表达量更高。 4）低温和冷藏处理后的石榴果实的表达谱中，石榴ZML1、TIFY3、JAZ4和JAZ7下调，JAZ6上调；JAZ8在冷藏后的表达量显著上调。ICE1-like在低温处理、冷藏处理、低温加冷藏处理中的表达量稳步提升。这些数据表明，在低温和冷藏处理过后，石榴TIFY家族应对刺激的表达模式并不单一，它们共同协作抵御寒冷带来的伤害。 5）外源MeJA处理后的石榴叶片的表达谱中，TIFY3和PPD11表达量在处理过后略微上升然后下调，JAZ7表达量在处理过后一直低于对照组，JAZ4、JAZ5、JAZ6、JAZ8、JAZ12、JAZ13、JAZ14、JAZ15在茉莉酸处理之后都有一个被快速诱导然后渐渐回落的过程，但绝大多数PgTIFYs在24小时之后表达量仍然高于对照组，ICE1-like也在短暂的下调之后回升。 6）荧光定量的结果表明，外源MeJA可调控PgTIFYs、MYC2-like和ICE1-like的基因表达水平，不同品种的TIFY基因对MeJA处理的敏感性不同，“突尼斯软籽”的ZML1、JAZ4、JAZ6显著上调，“红玉石籽”TIFY3、JAZ5、JAZ8、JAZ13和JAZ14的表达量也呈显著上升趋势。外源MeJA处理过后石榴ICE1-like的基因表达水平上调，“红玉石籽”ICE1-like的相对表达量在处理过后出现了显著提升，验证了之前的转录组数据，说明在茉莉酸处理下石榴果实对冷害的抵御能力得到了提升。 7）观察TIFY家族在低温冷藏处理后与不同品种间的表达模式。ZML9、TIFY3和JAZ7在低温冷藏处理后表达下调，在不同品种间表达模式为“突尼斯软籽”表达量高于“红玉石籽”；JAZ5、JAZ6、JAZ8和JAZ15在低温冷藏之后上调，在“红玉石籽”果实中表达量高于“突尼斯软籽”，这些基因或许与不同品种果实对冷害敏感度不同有关。比对低温冷藏和MeJA处理的转录组，在冷藏处理过后明显上调的JAZ8在MeJA处理后也显著上调，该基因或许与茉莉酸调控的ICE-CBF-COR抗寒通路有关联。 综上所述，ICE-CBF-COR是植物重要的抗寒信号通路，石榴ICE1-like和CBFs的活性会影响石榴果实对冷害的抵御，而茉莉酸处理可以对石榴ICE-CBF/DREB1转录通路释放上游信号，提升石榴ICE1-like的表达。作为JA信号通路上游关键因子的JAZ和MYC2-like基因在其中发挥着重要作用，未来或许可以将PgTIFYs作为在石榴采后冷藏保鲜的关键候选基因。
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