摘要
一：TLR7调控巨噬细胞极化在约氏疟原虫感染过程中的作用及机制研究 研究背景： 疟疾是由疟原虫引起的一种危及生命的疾病，通过受感染的雌性按蚊叮咬传播给人类。在2022年，疟疾病例总数达到2.49亿例，比2021年增加500万例。因此，疟疾仍然是一个重大的全球公共卫生问题。疟疾感染可诱导宿主产生强烈的固有免疫反应，可在早期有效地控制病原体数量，避免全身的传播。其中巨噬细胞在固有免疫中起着重要的作用，是抵抗疟疾感染的重要组成部分。巨噬细胞可以通过调理性或者非调理性作用介导吞噬、加工处理抗原提呈给T细胞，启动特异性免疫应答，以及分泌IL-6等细胞因子调节免疫反应。有研究表明感染过程中清除巨噬细胞后会显著降低控制疟原虫感染的能力，产生更严重的疟原虫血症并且导致过早的死亡。 组织驻留的巨噬细胞由胚胎前体细胞发育而来，具有自我更新的能力。在感染情况下，组织驻留的巨噬细胞还可以招募单核细胞来源的巨噬细胞。循环的单核细胞来源于骨髓造血祖细胞。巨噬细胞可分为两个功能亚群，即M1型和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞被认为是促炎型，产生促炎细胞因子，如TNF、IL-6等。M2型巨噬细胞是抗炎型，产生抗炎细胞因子如IL-10和TGF-β，用于组织修复及抑制炎症。据报道，伯氏疟原虫感染过程中，巨噬细胞会增加CD80的表达，同时在感染早期释放M1型相关的促炎细胞因子，如IL-12，并产生大量活性氧，以清除疟原虫。然而，疟原虫感染对巨噬细胞的功能调节机制以及其对适应性免疫应答的作用机制尚不完全清楚。 研究目的： 探究约氏疟原虫感染对巨噬细胞表型和功能的影响及分子调控机制以及巨噬细胞耗竭对适应性免疫应答和疟疾进展的影响，为疟疾的免疫调控机制提供新的理论认识，更可为基于巨噬细胞的疟疾免疫治疗提供新靶标和新策略。 研究方法： 1.构建约氏疟原虫NSM株感染的小鼠模型。 2.流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测感染后脾脏巨噬细胞比例和极化相关分子水平。 3.腹腔巨噬细胞与CFSE标记的疟原虫感染红细胞(iRBCs)共培养后用免疫荧光技术观察巨噬细胞的吞噬现象。 4.脾脏细胞和腹腔巨噬细胞与CFSE标记的iRBCs共培养后用FCM检测巨噬细胞的吞噬能力。 5.利用FCM检测感染后脾脏巨噬细胞产生ROS、NO和IFN-γ的能力以及凋亡水平。 6.应用FCM检测感染后的巨噬细胞中不同转录因子的磷酸化水平。 7.小鼠骨髓诱导的巨噬细胞(BMDMs)与iRBCs裂解液共培养后，FCM和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测巨噬细胞极化相关分子的表达水平。 8.小鼠BMDMs与iRBCs裂解液或小鼠感染血清共培养后用FCM检测巨噬细胞的吞噬能力、ROS和NO产生的能力。 9.小鼠BMDMs与iRBCs裂解液共培养后，FCM检测磷酸化STAT1、STAT3和AKT的水平。 10.利用STAT1和STAT3的抑制剂Fludarabinum、JSI-124进一步探讨STAT1、STAT3在感染中对巨噬细胞的极化和功能调节作用。 11.RT-qPCR检测腹腔巨噬细胞不同Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)的表达。 12.FCM检测感染的WT小鼠和TLR7-KO小鼠脾脏巨噬细胞极化分子的表达水平以及吞噬能力。 13.WT小鼠和TLR7-KO小鼠BMDMs与iRBCs裂解液共培养后用FCM检测巨噬细胞的极化水平。 14.小鼠感染后注射TLR7激动剂R848，观察小鼠感染体征，FCM检测巨噬细胞极化分子的表达水平。 15.小鼠BMDMs加入R848培养后，FCM检测巨噬细胞极化分子的表达水平以及吞噬能力。 16.利用Fludarabinum、JSI-124进一步探讨TLR7是否通过STAT1、STAT3影响巨噬细胞极化。 17.通过Clodronateliposome耗竭巨噬细胞研究其在疟原虫感染中的作用。 18.通过FCM检测巨噬细胞清除后T细胞比例以及活化分子的表达。 19.通过FCM检测巨噬细胞清除后B细胞比例和活化分子的表达。 20.应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测巨噬细胞清除后小鼠血清中抗疟原虫特异性抗体的水平。 研究结果： 1.成功构建疟原虫感染小鼠模型。 2.脾脏巨噬细胞比例在疟原虫感染第8天最高，并且巨噬细胞M1型相关分子(CD80、CD86、IL-6)表达显著升高，M2型相关分子(CD206、CD163、IL-10)表达显著降低。 3.感染后巨噬细胞吞噬能力显著增强，ROS、NO以及IFN-γ产生增多。 4.感染后巨噬细胞的凋亡水平显著下降。 5.感染后诱导巨噬细胞中的STAT1、STAT3、AKT磷酸化水平上升。 6.iRBCs裂解液在体外能诱导巨噬细胞并且增强M1型相关分子(CD80、CD86、MHC II)表达。 7.iRBCs裂解液在体外能增强巨噬细胞吞噬能力、ROS和NO的产生。小鼠感染血清对巨噬细胞吞噬作用、ROS和NO的产生没有明显影响。 8.iRBCs裂解液诱导BMDMs中的STAT1和STAT3磷酸化水平上升。STAT1抑制剂Fludarabinum可以抑制巨噬细胞M1型相关分子的表达，但不影响ROS的产生。STAT3磷酸化抑制剂JSI-124抑制巨噬细胞CD80的表达，促进CD86的表达，显著抑制ROS的产生和吞噬能力。 9.感染后巨噬细胞TLR7的表达高于TLR2、TLR3、TLR4。 10.与WT感染小鼠相比，TLR7-KO小鼠脾脏巨噬细胞M1型相关分子表达(CD80、CD86、GM-CSF、IL-6)下降，吞噬能力和产生ROS的水平显著下降。 11.WT和TLR7-KO小鼠BMDMs与iRBCs裂解液共培养，KO小鼠BMDMs的CD86和MHCII表达下降。 12.感染后注射TLR7激动剂R848，小鼠原虫率下降，红细胞数增加，脾脏重量减轻。 13.感染后注射R848，脾脏巨噬细胞CD80表达增强，CD206表达下降。 14.BMDMs加入R848后CD80和MHCII表达增强，吞噬能力增强。 15.STAT1抑制剂Fludarabinum不影响R848诱导的CD80的表达；STAT3磷酸化抑制剂JSI-124显著抑制R848诱导的CD80的表达。 16.体内清除巨噬细胞后，小鼠原虫率升高，体温下降。 17.巨噬细胞清除后T细胞CD40L、CD69和ICOS不同程度下降；CD4+T细胞不同亚群中，Th1和Th2细胞比例减少，Tfh细胞CD40L、CD69、ICOS、IFN-γ和IL-21表达下降。 18.巨噬细胞清除后生发中心B细胞和浆细胞比例下降，B细胞MHCII、CD69、CD80和CD86表达下降，小鼠血清中疟原虫特异性抗体的产生显著降低。 研究结论： 1.疟原虫感染后，脾脏巨噬细胞增多并且向M1极化。 2.疟原虫感染增强体内巨噬细胞的吞噬能力且促进STAT1、STAT3的活化。 3.iRBCs裂解液在体外诱导BMDMs向M1极化，增强BMDMs吞噬能力。 4.STAT1和STAT3可调控巨噬细胞的极化和功能。 5.TLR7通过STAT3影响巨噬细胞的极化和吞噬能力。 6.TLR7激动剂R848减轻疟疾感染体征，诱导巨噬细胞向M1极化，增强其吞噬能力。 7.巨噬细胞清除加重疟疾感染体征，T细胞活化下降，CD4+T细胞亚群减少；B细胞活化下降，浆细胞减少，抗体产生减少。 二：PD-1+巨噬细胞在疟原虫感染过程中的特点及作用 研究背景： 程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)在肿瘤和感染性疾病中是免疫抑制信号的关键介质，表达在活化的T细胞与B细胞上。在肿瘤治疗中，阻断PD-1/PD-L1的单抗在一些患者中显示出显著的临床疗效。在疟原虫感染过程中，T细胞与B细胞PD-1表达上调，并且PD-1的上调会损害T细胞功能。PD-1的敲除可快速且完全的清除疟原虫；PD-1阻断后小鼠疟原虫血症降低，树突状细胞、辅助T细胞和生发中心B细胞显著增加。此外，使用抗体阻断PD-L1也可改善CD4+T细胞的功能从而加速疟原虫的清除。 此外，PD-1在髓系细胞中的表达及其作为治疗靶向的潜力也开始受到重视。在肿瘤中，髓系细胞在抗肿瘤免疫和肿瘤进展中发挥着重要作用，肿瘤相关巨噬细胞可高表达PD-1，并且与抑制吞噬作用和向M2型巨噬细胞极化相关。体内阻断PD-1/PD-L1可增强巨噬细胞的吞噬功能，从而抑制肿瘤生长，可成为肿瘤的潜在治疗靶点。在细菌感染模型中，巨噬细胞也可表达高水平的PD-1，高表达的PD-1与杀菌能力降低有关，从而导致持续的感染。然而疟原虫感染后巨噬细胞PD-1的表达情况，及其与功能的关系仍知之甚少。 研究目的： 探究约氏疟原虫感染过程中巨噬细胞PD-1的表达与功能之间的关联，研究诱导巨噬细胞高水平表达PD-1的机制，以发现新的潜在治疗靶点，为疟疾预防和治疗提供理论支撑。 研究方法： 1.使用FCM、RT-qPCR和免疫荧光技术检测疟原虫感染后巨噬细胞PD-1的表达情况。 2.小鼠BMDMs与完整RBCs、RBCs裂解液、小鼠血清共培养后，FCM检测PD-1水平。 3.FCM检测感染后CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、MDSC和树突状细胞PD-1和PD-L1的表达情况。 4.流式分选PD-1+和PD-1-巨噬细胞进行RNA测序，观察其功能差异。 5.FCM检测感染后PD-1+和PD-1-巨噬细胞的吞噬功能、ROS产生和凋亡水平。 6.FCM检测感染后PD-1+和PD-1-巨噬细胞的CD80和CD86水平。 7.流式分选PD-1+和PD-1-巨噬细胞与CFSE标记的脾细胞共培养后检测T细胞的增殖。 8.流式分选PD-1+和PD-1-巨噬细胞与脾细胞共培养后检测T细胞的活化分子的表达。 9.BMDMs加入STAT1和STAT3的抑制剂Fludarabinum、JSI-124后FCM检测PD-1的表达。 10.ELISA检测小鼠血清中IL-6、GM-CSF和IL-10的水平。 11.BMDMs单独加入IL-6、GM-CSF和IL-10或者联合加入JSI后检测PD-1的表达。 研究结果： 1.疟原虫感染后巨噬细胞PD-1表达显著升高。 2.完整iRBCs、iRBCs裂解液和感染血清在体外均能诱导巨噬细胞表达PD-1。 3.感染后CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、MDSC和树突状细胞PD-1和PD-L1显著上升。 4.RNA测序结果提示PD-1+巨噬细胞吞噬杀伤能力下降、凋亡升高，抗原提呈能力增强。 5.流式结果显示PD-1+巨噬细胞吞噬能力下降、ROS产生更少，凋亡水平上升。 6.流式结果显示PD-1+巨噬细胞CD80和CD86表达更高。 7.PD-1+巨噬细胞显著增强T细胞的增殖，促进CD4+T细胞的活化水平。 8.STAT1抑制剂Fludarabinum不影响PD-1的表达，STAT3抑制剂JSI-124显著抑制PD-1的表达。 9.感染后血清中IL-6、GM-CSF和IL-10水平显著升高。 10.IL-6、GM-CSF和IL-10均能诱导PD-1的表达，同时加入JSI后显著抑制其诱导的PD-1的表达。 研究结论： 1.疟原虫感染后显著诱导巨噬细胞PD-1的表达。 2.疟原虫感染后诱导CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、MDSC和树突状细胞PD-1和PD-L1的表达。 3.PD-1的表达抑制巨噬细胞吞噬杀伤能力，促进其凋亡。 4.PD-1+巨噬细胞促进T细胞增殖和活化。 5.IL-6/GM-CSF/IL-10通过STAT3诱导巨噬细胞PD-1的表达。
NETL