摘要
橡胶树是重要的热带经济作物，是国家战略物质天然橡胶的主要来源。我国橡胶树种植区地处热带北缘，容易受到寒害胁迫导致减产，威胁到我国橡胶树种植业的可持续发展。橡胶树萜类化合物与天然橡胶的合成共享五碳前体合成途径，研究萜类化合物的合成及其在低温胁迫及相关激素信号中的表达调控有助于阐明天然橡胶与萜类合成的底物分配及低温响应机制。萜类合酶(Terpene synthas e, TPS)作为催化萜类化合物合成的核心酶也成为新的研究热点。然而，目前对橡胶树TPS基因家族在大戟科中的分类特点及其在橡胶树中的表达调控与酶学功能尚缺乏系统的研究。因此，本研究利用生物信息学方法筛选鉴定TPS基因家族成员，分析其在大戟科中的特征分布，并对橡胶树TPS基因的组织表达以及对低温和激素处理下的表达模式进行了综合分析，同时对高响应基因与橡胶树中独特的TPS基因进行酶学功能分析，最终筛选获得5个重要的HbTPSs(HbTPS2、HbTPS11、HbTPS21、HbTPS31、HbTPS45)。主要研究结果如下： (1)利用生物信息学方法鉴定了大戟科中木薯、蓖麻、麻疯树、续随子和橡胶树的TPS基因家族。结果发现，这五种植物分别含有47、22、40、38和70个TPS基因。通过系统发育树分析，这些TPS基因被划分为5个亚家族(TPS-a至TPS-g)。在TPS-a、TPS-b、TPS-e/f和TPS-g亚家族中均含有大戟科特有分支，推测这些基因在大戟科TPS基因家族中可能演化出新功能。此外，在TPS-e/f4亚亚家族中存在一簇具有共同祖先的橡胶树特有TPS基因簇(HbTPS25-HbTPS29)。 (2)橡胶树TPS基因家族染色体分布、基因结构、亚细胞定位和启动子顺式作用元件分析。橡胶树TPS基因的染色体定位结果表明，HbTPS基因成员不均匀地分布在15条染色体上；复制事件分析发现橡胶树TPS基因家族扩增的主要原因是串联复制；亚细胞定位预测分析表明，HbTPS大部分定位于叶绿体，少数分布在细胞质、细胞核、线粒体等；基因结构分析表明HbTPSs基因的内含子个数在4到14个不等；HbTPSs基因启动子上游的顺式作用元件种类丰富，含有植物生长发育、胁迫响应和植物激素响应元件，但差异较大，说明这些HbTPS基因可能参与了对橡胶树不同生物学过程的响应与调控。 (3)橡胶树TPS基因的组织、冷胁迫和激素处理下的表达模式分析。大多数HbTPS在各组织中表达量较低，然而HbTPS19和HbTPS21在橡胶树形成层和叶子中的表达量远高于其他组织。在橡胶树耐寒和敏感品种中的表达分析发现，25个HbTPSs基因在两个品种中均发生了显著的变化，其中HbTPS31基因在耐寒品种冷胁迫处理24h时显著上调，而在不耐寒品种2h冷胁迫处理下显著上调后，随着处理时间的增加其表达又显著下调。乙烯利和茉莉酸甲酯激素处理下，34个HbTPSs基因的表达发生了显著变化。割胶处理下HbTPS11基因的表达显著上调。此外，橡胶树死皮和健康皮的差异基因表达分析发现HbTPS51和HbTPS53基因的表达在死皮树中显著上调，说明HbTPS51和HbTPS53基因可能参与了橡胶树死皮的反应。 (4)HbTPS表达载体构建和酶学功能分析。结合TPS基因家族系统发育和转录组数据分析，克隆了大戟科特有进化分支中的5个HbTPS基因，并对它们的二级氨基酸结构、蛋白质三维结构、跨膜结构域、信号肽和磷酸化位点进行了分析。利用体外酶功能检测方法发现HbTPS11和HbTPS21催化GPP分别生成单萜化合物芳樟醇和桧烯；而HbTPS2催化FPP生成α-古巴烯、Δ-杜松烯、古巴烯、大根香叶烯D和γ-榄香烯等多倍半萜产物；而HbTPS31和HbTPS45仅生成单一产物，分别为反式橙花叔醇和倍半萜类生物合成的重要中间体(Hedycaryol)。 综上，通过对橡胶树萜类合酶在大戟科中的系统进化和表达模式分析，本研究成功鉴定出5个HbTPSs基因，并对其进行了异源表达和酶学功能分析。本研究为进一步阐明橡胶树萜类合酶基因在橡胶树低温胁迫、割胶与死皮发生等重要生物学过程中的功能奠定重要的研究基础。
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