摘要
【研究背景和目的】 脓毒症心功能障碍是一种基于全身感染和炎症的急性心脏功能障碍综合征，主要临床表现为心泵功能障碍和血流动力学异常，是脓毒症患者死亡的主要原因。尽管近年来医疗技术取得了显著的进步，但是业界对于脓毒症心功能障碍的治疗缺乏十分有效的治疗药物。因此，开发有效和精确的药物是至关重要的。 先前的研究报道发现脓毒症心功能障碍与铁死亡相关。此外，核因子红细胞生成素-2相关因子2(Nrf2)是一种至关重要的转录因子，负责调节与氧化应激相关的基因表达、维持细胞的氧化还原稳态，参与并调控铁死亡的过程。 桃核承气汤是一种经典的中药方剂，具有改善血流、抗炎、保护线粒体、预防纤维化等多种药理作用。然而，桃核承气汤治疗脓毒症心功能障碍的潜在作用机制尚不清楚。本研究首先探讨桃核承气汤对脓毒症心功能障碍的作用，并深入探索该作用是否通过激活Nrf2调控铁死亡改善脓毒症心功能障碍。 【实验方法】 1.选取C57/BL6小鼠，用桃核承气汤(2 g/kg、4 g/kg)灌胃预处理5天后采用盲肠结扎穿孔术(CLP)构建脓毒症模型，术后给药并观察小鼠术后72小时内的生存情况。 2.选取C57/BL6小鼠，用桃核承气汤(2 g/kg、4 g/kg)灌胃预处理5天后，采用CLP构建脓毒症模型，并以地塞米松(40 mg/kg)为阳性对照。24小时后进行动态心电图检测并取心脏组织进行研究。使用HE检测心肌组织的结构形态变化，血清检测CK-MB、cTnT、LDH等心肌损伤指标，化学荧光法检测Nrf2、ACSL4、4-HNE含量及ROS水平，试剂盒检测心肌组织中脂质过氧化的含量及铁沉积。ELISA和WesternBlot法检测脓毒症中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及脓毒症中铁死亡相关蛋白GPX4、TfR1、Nrf2、HO-1、NQO1的表达。 3.采用高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-Q-Exactive-MC)技术分析桃核承气汤成分及其常见有效成分。 4.采用网络药理学方法分析桃核承气汤治疗脓毒症心功能障碍的主要靶点及通路。 5.采用细胞热迁移分析(CETSA)检测桃核承气汤对Nrf2热稳定的影响。 6.选取大鼠乳鼠原代心肌细胞为研究对象，建立RSL3诱导的铁死亡模型，并给予不同浓度的桃核承气汤。通过CCK-8检测细胞活力；电镜和JC-1荧光探针观察细胞线粒体变化；检测脂质过氧化物GSH、MDA含量、细胞中Fe2+、ROS水平；WesternBlot法检测铁死亡相关蛋白表达(如TfR1、GPX4、Nrf2、HO-1、NQO1等)。进一步探讨桃核承气汤的药理机制。 7.使用Nrf2抑制剂ML385(10μM)和Nrf2+/−敲除小鼠来验证桃核承气汤是否通过Nrf2介导的铁死亡信号通路对脓毒症心功能障碍发生保护作用。 【结果】 1.桃核承气汤可保护CLP诱导的小鼠心脏损伤。生存曲线、心脏超声、HE染色和血清CK-MB、cTnT和LDH检测显示桃核承气汤可提高小鼠生存率、减轻小鼠心脏损伤改善心功能，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。 2.桃核承气汤可抑制心肌铁死亡和全身性炎症反应。化学荧光法、比色法铁含量检测、脂质过氧化物检测、ELISA和Westernblot等结果显示，模型组的ROS、铁沉积增多，脂质过氧化物GSH含量下降、MDA、ACSL4和4-HNE水平显著增加，炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β表达显著升高，铁死亡蛋白TfR1蛋白表达显著升高、GPX4显著降低，差异均具有统计学意义(Plt;0.05)。桃核承气汤能逆转上述改变，且对比模型组，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。 3.Nrf2是桃核承气汤中治疗脓毒症心功能障碍的关键靶点。通过HPLC-Q-Exactive-MC与网络药理学分析，并结合CETSA实验显示，Nrf2可能是桃核承气汤对脓毒症心功能障碍进行保护的主要靶点。 4.桃核承气汤在体内激活Nrf2信号通路。Westernblot和免疫荧光法显示，桃核承气汤激活了心脏组织中的Nrf2，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。 5.桃核承气汤抑制RSL3诱导的铁死亡改善氧化应激。CCK-8、脂质过氧化物检测、电镜、DCFH-DA染色、铁橙荧光探针检测、JC-1染色结果显示，桃核承气汤可呈剂量依赖性减轻RSL3诱导的铁死亡，改善氧化应激，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。 6.桃核承气汤激活Nrf2抑制RSL3诱导的铁死亡。通过Westernblot检测铁死亡关键蛋白表达和Nrf2信号通路。Westernblot结果显示，对照组相比，RSL3组显著上调TfR1表达并同时下调GPX4表达；桃核承气汤能剂量依赖性地降低TfR1表达，并呈剂量依赖性地上调GPX4、Nrf2及其下游蛋白HO-1和NQO1的表达，差异均具有统计学意义(Plt;0.05)。 7.抑制Nrf2可减轻桃核承气汤对心肌细胞铁死亡的抑制。在构建铁死亡模型后，加入Nrf2抑制剂ML385，CCK-8结果显示桃核承气汤抗细胞铁死亡能力下降，ML385抵消了桃核承气汤升高GSH水平的作用。与上述结果一致，桃核承气汤对细胞内MDA水平、ROS水平、Fe2+含量和MMP的抑制作用均被ML385处理过后逆转。此外，Westernblot结果显示，与RSL3组相比，桃核承气汤组中TfR1的蛋白表达减少，而GPX4、Nrf2及其下游靶点的蛋白表达增加。ML385处理逆转桃核承气汤作用，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。 8.体内敲减Nrf2抑制了桃核承气汤对脓毒症心功能障碍的保护作用。HE、DHE染色、血清CK-MB和cTnT检测显示，在Nrf2+/-小鼠中，桃核承气汤(4 g/kg)治疗组改善脓毒症心功能障碍和氧化应激的作用比其在Nrf2+/+小鼠中作用弱；Westernblot结果显示，Nrf2+/-小鼠与Nrf2+/+小鼠相比，前者桃核承气汤治疗组抗铁死亡能力减弱，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。 【结论】 1.桃核承气汤改善小鼠脓毒症心功能障碍及小鼠炎症反应。 2.Nrf2是桃核承气汤改善脓毒症心功能障碍的关键靶点。 3.桃核承气汤可激活Nrf2调控下游NQO1、HO-1的蛋白表达。 4.桃核承气汤通过激活Nrf2抑制铁死亡改善脓毒症后氧化应激及心功能障碍。 5.敲减Nrf2后，桃核承气汤改善脓毒症后心肌铁死亡、氧化应激及心功能障碍的能力减弱。
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