摘要
背景：成骨不全(Osteogenesis Imperfecta，OI)，是一类以骨脆性增加、自发性骨折为主要特征的罕见先天性骨骼发育障碍疾病，其发病率为1/20000~1/15000，病情严重者可致残、致死。大部分病例主要是由于Col1a1和Col1a2的常染色体显性突变导致的，这两个突变分别编码I型胶原蛋白的α1(I)链和α2(I)链，但近年不断有新的致病基因被发现。2013年，在新英格兰医学杂志上首次报道Wnt1基因突变可致成骨不全。Wnt1基因所编码的WNT1分子是WNT信号通路的关键配体，是一类分泌型糖蛋白。然而迄今为止，Wnt1突变导致OI的分子机制尚且不清。 目的：(1)筛选并证明新的成骨不全致病基因或新突变，扩大致病遗传图谱；(2)探索Wnt1突变导致成骨不全的分子机制，进而为药物治疗此类疾病提供可能的靶点。 方法：在临床上收集一例先天性成骨不全患儿及其父母的外周血样，进行全基因组测序及Sanger测序发现该患儿存在一种新的突变，即Wnt1.c.104+1Ggt;A。利用CRISPR/Cas9技术构建携带该突变的人源化大鼠模型。使用组织化学染色(阿利新蓝茜素红双染色、HE染色、VonKossa染色、钙黄绿素)、X光、microCT扫描结合3D重构分析等静态和动态骨组织计量学方法验证该模型的成骨不全表型。通过Realtime-PCR、Westernblot、5’RACE等分子生物学方法分析Wnt1新突变对WNT1分子的影响。培养原代Wnt1突变成骨祖细胞并诱导向成骨细胞分化，通过Realtime-PCR、Westernblot检测不同时期分化因子如ALP、COL1A1、BGLAP、DMP1等的表达变化分析成骨细胞分化是否异常，通过茜素红染色(Alizarin Red Staining)、ALP染色等方法分析成骨细胞的矿化活性。 结果：对一例成骨不全家系进行全基因组测序以及Sanger测序，发现了一种Wnt1的新突变(c.104+1Ggt;A)。为进一步证明该突变的致病性，我们构建了携带该突变的人源化大鼠，组织化学染色、X光、microCT扫描分析均显示该模型具有骨量减少、易骨折等骨骼系统缺陷样成骨不全样表型。通过Realtime-PCR和westernblot，初步分析了Wnt1的新突变对WNT1分子的影响，发现与正常WNT1分子相比，突变大鼠的WNT1表达量下降。为了进一步探索Wnt1新发突变导致成骨不全的原因，我们通过原代培养分别从3日龄WT和Wnt1突变大鼠颅骨分离原代成骨祖细胞进行培养。通过Realtime-PCR和westernblot，发现Wnt1突变大鼠成骨细胞分化因子在不同时期呈现出不同的变化趋势。采用碱性磷酸酶染色发现了成骨细胞在早期分化时期，分化能力下降，茜素红染色发现了成骨细胞晚期矿化能力下降。为了更进一步探索Wnt1新发突变导致成骨不全的分子机制，我们通过Realtime-PCR和westernblot发现WNT/β-Catenin通路活性增高。 结论：对一例成骨不全家系的研究中,我们发现了Wnt1基因的一种新型突变Wnt1c.104+1Ggt;A。模拟此新发突变构建了人源化大鼠动物模型，发现该大鼠表现出与患者相似的成骨不全表型，证实该新突变为此家系的致病遗传因素。该突变使得WNT1分子的表达量下降。对其大鼠进行原代培养，发现突变大鼠成骨祖细胞向成骨细胞和骨细胞分化的过程中，成骨细胞分化能力下降，成骨细胞矿化能力下降，WNT/β-Catenin通路活性增高。因此，该突变导致了骨量减少、易骨折等骨骼系统缺陷，以及成骨细胞分化和矿化能力下降，WNT/β-Catenin通路活性增高，使成骨祖细胞不能正常的向成骨细胞和骨细胞分化，破坏了骨骼发育动态平衡，可能是Wnt1突变导致成骨不全的主要原因。
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