摘要
目的: 近视是一种常见的屈光不正，发病率极高，发病年龄呈提前趋势，已成为影响我国青少年眼部健康的一个重大公共卫生问题。近年来，ON型双极细胞作为研究的焦点，被发现在近视发病机制的研究中起到关键作用。在视觉传导中，视网膜细胞在视觉信号加工处理及传递中发挥重要作用，但视网膜细胞种类很多，具体哪类细胞在其中起关键作用并不清楚，作用机制也尚不明确。本课题组拟通过近视小鼠视网膜单细胞转录组测序结果，明确其中发挥关键作用的视网膜细胞及作用机制。结果发现，视觉变化通路主要是视杆细胞-视杆双极细胞—AII无长突细胞-视神经节细胞通路，在复杂的视网膜各类神经元中占比最大、且差异基因分析得到差异性最显著的集群是视网膜视杆双极细胞(rod polar cell, RBC)，且在哺乳动物中，视杆双极细胞处于视觉信号转导的关键节点。为了明确RBC在近视中的作用，通过特异性敲除RBC上关键基因—蛋白激酶C,α型(ProteinkinaseCalphatype;PKC-α,prkcα)，来明确RBC在近视发生发展中的作用。因此，我们构建了特异性敲除视网膜视杆双极细胞的Prkcαfl/fl-Pcp2-iCre＋小鼠，明确Prkca特异性敲除是否会影响小鼠正常的屈光发育及形觉剥夺性近视(Form Deprivation Myoia, FDM)，进一步阐述其可能的作用机制。 PKCα是一种常规的、钙离子激活的、二酰基甘油依赖的PKC同工酶，常作为视网膜中特异性标记视杆双极细胞的抗体。 方法： 首先委托公司用CRISPR-Cas9技术构建Prkcα-Flox小鼠和Pcp2-iCre小鼠，繁配出所需要的特异性敲除视网膜视杆双极细胞Prkcα的Prkcafl/fl/Pcp2-iCre＋小鼠和Prkcafl/fl/Pcp2-iCre-小鼠。通过PCR基因型鉴定和免疫荧光验证RBC上Prkcα是否敲除成功。对4周龄和12周龄的Prkcα基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠拍摄眼底照片及眼底血管荧光造影排除基因敲除对眼底造成的影响。对Prkcα基因敲除小鼠及同窝野生型小鼠在出生后4周开始每隔两周，直至小鼠12周龄大时，共计5个年龄段利用红外偏心摄影验光仪(Eccentric Infrared Photoretinoscope, EIR )检测小鼠的屈光度，并用频域光学相干断层扫描仪(Optical Coherence Tomography, OCT)检测小鼠眼轴长度等眼部生物学参数。与此同时，选取5周龄小鼠对其进行视动反应(Optomotor Response, OMR )的检测和视网膜电图(Electroretinogram, ERG)的检测。形觉剥夺性近视诱导实验则在小鼠4周龄大时选取双眼无屈光参差、瞳孔大小相近的Prkcα基因敲除小鼠及同窝野生型小鼠 进行。将小鼠随机分为敲除小鼠对照组(Prkcα/Pcp2-iCre＋)、敲除小鼠剥夺组(Prkcα/Pcp2-iCre+-FD)、野生型小鼠对照组(Prkcα/Pcp2-iCre-)和野生型小鼠剥夺组(Prkcα/Pcp2-iCre--FD)。对剥夺组开展2周持续性形觉剥夺模型准备，在被试小鼠右眼戴上眼罩进行，对照组不做任何处理，所有小鼠保证处于相同饲养环境。实验结束后测量四组小鼠的屈光度和眼部生物学参数。 结果： 1.Prkcα基因敲除小鼠的视网膜PRKCA表达在ON型双极细胞的胞体所处的内核层明显降低，说明Prkcα基因敲除成功。 2.Prkcα基因的敲除不会影响眼底血管分布及视网膜各层结构形态，Prkcα基因敲除小鼠可作为一个屈光发育研究模型，进行后续屈光发育研究。 3.Prkcα基因敲除小鼠较同窝野生型小鼠相比明显向远视方向发展(双因素重复测量方差分析,plt;0.01)，但在发育早期(4周龄)二者之间没有统计学差异，且两者屈光均呈现先向远视，而后向近视方向偏移的发育趋势；此外，Prkcα基因敲除小鼠的前房深度、晶体厚度和眼轴长度与野生型小鼠相比均延长(双因素重复测量方差分析,plt;0.05)。 4.在形觉剥夺实验2天及2周后，剥夺组小鼠的被剥夺眼相较对侧眼，都诱导出了一定的近视进展量，但Prkcα基因敲除小鼠与同窝野生型相比无明显统计学差异(独立样本t检验,pgt;0.05)。 5.5周龄小鼠视网膜电图结果表示，暗适应不同强度的刺激下，Prkcα基因敲除小鼠的a波代表光感受器电活动，b波代表ON型双极细胞电活动，其二者的波幅较同窝野生型小鼠的波幅明显升高(双因素重复测量方差分析,plt;0.05)，但明适应条件下二者之间没有明显差异。 6.5周龄小鼠视动反应的结果显示，在不同刺激频率下，Prkcα基因敲除小鼠的视动反应与同窝野生型小鼠没有统计学差异(双因素重复测量方差分析,pgt;0.05)。 结论： 综上，Prkcα基因敲除影响小鼠正常屈光发育，但不影响小鼠形觉剥夺性近视的形成。对Prkcα基因的特异性敲除的研究有助于我们后续探索ON型双极细胞对视觉发育的影响及相关机制。
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