摘要
目的：运用网络药理学方法预测柴胡桂枝干姜汤(chaihu guizhi ganjiang decoction, CGGD)治疗重度抑郁症的有效活性成分及作用靶点，并通过体内动物实验研究其可能的作用机制。 方法： 网络药理学：通过TCMSP和BATMAN-TCM数据库筛选CGGD的有效活性成分及作用靶标，使用DisGeNET、GeneCards数据库获取重度抑郁症(major depressive disorder, MDD)的相关靶点，将MDD的相关靶点与CGGD的有效活性成分进行映射，得到CGGD治疗MDD的潜在作用靶点。借助Cytoscape3.9.1软件将网络可视化，构建“中药-成分-疾病-靶点”图。使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络，并使用Cytoscape3.9.1中的Centiscape工具进行网络拓扑分析。利用R软件包org.Hs.eg.db(version 3.1.0)和ClusterProfiler(version 3.14.3)进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能富集分析。 实验研究：通过腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)建立小鼠重度抑郁模型。采用105只6-8周龄，体重(18-22 g)的SPF级雄性C57BL/6J小鼠，用简单随机法将小鼠随机分为对照(Control)组、Control+CGGD高剂量组(7.18 g/kg)、LPS组、LPS+CGGD低剂量(1.79 g/kg)组、LPS+CGGD中剂量(3.59 g/kg)组、LPS+CGGD高剂量(7.18 g/kg)组、氟西汀(2.6 mg/kg)组，每组15只。预防性给药7天后，连续7天腹腔注射LPS250μg/kg制备小鼠重度抑郁模型，给药组分别灌胃CGGD1.79、3.59、7.18g/kg和氟西汀(fluoxetine, FLX)2.6mg/kg，每日1次，连续给药7天；Control组与LPS组给予等体积的双蒸水。采用糖水偏好实验(sucrose preference test, SPT)和旷场实验(open field test, OPT)检测是否成功建立小鼠重度抑郁模型；免疫荧光法检测小鼠海马中星形胶质细胞功能异常的标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)与小胶质细胞活化的标志物离子钙接头蛋白(ionized calcium binding adapter molecule-1, Iba-1)的表达；酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测小鼠血清中白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-18(interleukin-18, IL-18)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、白介素-10(interleukin-10, IL-10 )、活性氧(reactive oxygen species, ROS )、丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量及过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活力；采用蛋白质免疫印迹法(western blot, WB)检测小鼠海马中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nod-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine-requiring aspartate protease, Caspase 1 )、N端消皮素D(N-gasdermin D, N-GSDMD)、IL-18和IL-1β蛋白的表达情况；16SrDNA测序技术分析CGGD对小鼠重度抑郁模型粪便菌群的alpha多样性、beta多样性的影响，以及CGGD干预对小鼠重度抑郁模型粪便门水平物种相关丰度的影响；运用RNA-seq技术分析小鼠回肠差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，并对DEGs进行GO和KEGG功能富集分析；苏木精-伊红染色法(hematoxylin and eosin staining, Hamp;E)观察小鼠回肠病理形态变化。 结果： 网络药理学：筛选得到CGGD有效活性成分174个、对应靶点407个；疾病靶点4976个；药物疾病交集靶点289个；度中心性(degree centrality, DC)值排名靠前的活性成分有槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、18-β-甘草次酸、汉黄芩素、异鼠李素、二氢木蝴蝶素A、黄芩素、18-α-甘草次酸等；PPI网络获得关键靶点53个，介数中心度(betweenness centrality, BC)值排名靠前的核心靶点为IL6、TNF、ESR1、IL1B、TP53、PPARG、AKT1、GSK3B、EGFR、PTGS2等。基于289个关键靶点，通过GO功能富集分析共得到GO条目3411条(Plt;0.05)，包括生物过程(biological processes, BP)2960条，细胞组分(cellular components, CC)155条，分子功能(molecular functions, MF)296条。这些靶点主要作用于膜筏、膜区、电压门控钙离子通道复合物、突触后膜和突触膜等，涉及对药物的反应、细胞对化学应激的反应、膜电位的调节、对脂多糖的反应、对氧化应激的反应、活性氧代谢过程等生物过程，影响神经递质受体活性、电压门控钙通道活性、突触后神经递质受体活性、配体激活转录因子活性和氧化应激等。KEGG通路富集分析共获得201条相关信号通路(Plt;0.05)，包括MAPK、IL-17、PI3K-Akt、TNF、HIF-1、NF-κB、神经营养因子、Toll样受体、NOD样受体信号通路等。 实验研究：LPS组较Control组小鼠糖水偏好指数明显降低(Plt;0.01)，旷场实验进入中心区域次数、平均移动速度、在中心区域停留时间等均显著下降(Plt;0.01)；海马星形胶质细胞功能异常和小胶质细胞活化的平均荧光强度明显升高(Plt;0.01)；小鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6、ROS和MDA的含量显著增加(Plt;0.01)，IL-10的含量及CAT、GSH-Px和SOD的活力显著降低(Plt;0.01)；小鼠海马中NLRP3、ASC、Caspase1、N-GSDMD、IL-18和IL-1β蛋白表达明显增加；粪便菌群α多样性中shannon和simpson指数降低、β多样性中主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)，LPS组与Control组的组间的距离比LPS+CGGD高剂量组与Control组的组间距离更远、门水平上厚壁菌门/拟杆菌门(Firmicutes/Bacteroidetes)的比值升高(Plt;0.05)。LPS+CGGD各剂量组较LPS组小鼠糖水偏好指数升高(Plt;0.05、0.01)，旷场实验进入中心区域次数、平均移动速度、在中心区域停留时间等明显上升(Plt;0.05、0.01)；海马星形胶质细胞功能异常和小胶质细胞活化的平均荧光强度明显降低(Plt;0.01)；小鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6、ROS和MDA的含量显著降低(Plt;0.05、0.01)，IL-10的含量和CAT、GSH-Px和SOD的活力明显增加(Plt;0.05、0.01)；小鼠海马中NLRP3、ASC、Caspase1、N-GSDMD、IL-18和IL-1β蛋白表达明显降低(Plt;0.05)；粪便菌群α多样性中shannon和simpson指数升高；门水平上Firmicutes/Bacteroidetes的比值降低(Plt;0.05)。RNA-seq结果显示，LPS组与Control组相比，有1681个DEGs，LPS+CGGD高剂量组与LPS组相比，有993个DEGs，而CGGD治疗影响的1680个DEGs中，有687个DEGs与LPS诱导的重度抑郁相关，包括AKT1、FOS、IL-10、PLK1、GPT、ACTN2、FASN、CCND1、ESPL1和ACTA2等。此外，GO功能富集分析显示，DEGs主要集中在细胞质、细胞骨架、线粒体、基底膜等，涉及谷胱甘肽代谢过程、跨膜转运、调节神经炎症反应、质膜融合、对细菌源性分子的反应、NLRP3炎症小体复合体组装等生物过程，影响催化活性、丝氨酸水解酶活性、谷胱甘肽转移酶活性、跨膜转运活性、氧化还原酶活性、ATP水解活性、趋化因子活性、白细胞介素-10受体结合等。KEGG通路富集分析涉及药物代谢-其他酶、氨基酸和核苷酸糖代谢、视黄醇代谢、丙酮酸代谢、TNF信号通路、雌激素信号通路、谷胱甘肽代谢、鞘磷脂代谢、IL-17信号通路等。镜下观察小鼠回肠Hamp;E染色结果显示，Control组小鼠回肠黏膜和绒毛结构较为完整，LPS组小鼠回肠严重受损，CGGD治疗后小鼠的回肠黏膜和绒毛结构修复，与Control组较为相近。 结论： 网络药理学： (1)CGGD治疗重度抑郁症的主要活性成分可能是槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、18-β-甘草次酸、汉黄芩素、异鼠李素、二氢木蝴蝶素A、黄芩素、18-α-甘草次酸等。这些活性成分作用的核心靶点包括IL6、TNF、ESR1、IL1B、TP53、PPARG、AKT1、GSK3B、EGFR、PTGS2、BCL2、CASP3、JUN、HSP90AA1、CYCS等。 (2)这些靶点主要作用于膜筏、膜区、电压门控钙离子通道复合物、突触后膜和突触膜等，涉及对药物的反应、细胞对化学应激的反应、膜电位的调节、对脂多糖的反应、对氧化应激的反应、活性氧代谢过程等生物过程，影响神经递质受体活性、电压门控钙通道活性、突触后神经递质受体活性、配体激活转录因子活性和氧化应激等。通过调控免疫、炎症、凋亡、焦亡等多个信号途径发挥作用。。 实验研究： (1)CGGD通过减轻神经炎症和氧化应激发挥抗LPS诱导的小鼠抑郁样行为。 (2)CGGD抗重度抑郁的作用与其抑制NLRP3介导的细胞焦亡途径和抑制肠道菌群失调有关。
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