摘要
研究目的 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的发病机制在我国主要与乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染紧密相关。乙肝肝硬化肝癌的发生发展通常经历从慢性乙型病毒性肝炎到肝硬化，再到早期、晚期肝癌的过程。而肠道菌群通过肠-肝轴在肝脏疾病中发挥着关键作用。尽管近年来已有大量研究解释了乙肝相关肝癌患者的肠道微生态存在明显紊乱失调，但关于微生物及其代谢产物在疾病演进过程中是否存在特定的动态变化模式尚未得到深入探究。此外，目前临床上HCC仍缺乏一个高特异、高敏感性的诊断指标，因此迫切需要探索出能够有效诊断高危人群中HCC发生的生物标志物。故本研究旨在通过比较乙肝肝硬化肝癌在疾病发展的各个阶段中肠道菌群及其代谢产物的变化情况，表征肠道菌群及代谢产物与肝癌发生发展之间的相互关系，并通过机器学习模型评估肠道微生物组作为乙肝相关性肝癌的生物标志物的临床潜力，为肝癌的早期诊断和治疗提供新的策略和视角。 研究方法 本研究随机纳入2021年10月至2022年3月期间在温州医科大学附属第一医院就诊的乙肝感染未癌变患者(乙肝感染组，HBV组)83例、乙肝感染相关肝癌患者(肝癌组，HCC组)90例及同期体检中心的健康志愿者44例(Control组)。再根据乙肝慢性进展的临床阶段，将乙肝感染组分为慢性乙型病毒性肝炎组(CHB组)48例和肝硬化组(LC组)35例，肝癌组则分为早期肝癌组(eHCC组)49例和晚期肝癌组(aHCC组)41例。收集所有研究对象的粪便样本及临床资料，对粪便样本进行16SrRNAV3-V4区扩增子测序检测菌群组成，LC-MS技术非靶向检测粪便代谢物，根据测序结果分析组间微生物的多样性、差异物种、差异代谢物、细菌表型及代谢通路功能预测等，菌群和代谢物之间的相关性分析采用Spearman秩相关。结合LASSO回归和XGBoost两种特征选择算法识别与HCC相关的菌群及代谢特征，构建具有早期诊断效能的微生物模型。 研究结果 1.肠道菌群多样性分析结果：Alpha多样性分析可见，HCC组相较于HBV组chao1指数即丰富度明显降低(Plt;0.01)，且随着疾病不断进展，在CHB、LC、eHCC、aHCC的组间呈逐渐降低趋势。Beta多样性分析则发现Control、HBV和HCC各组内的个体微生物群落结构组成形成了明显聚类，且组与组之间的菌群群落结构存在一定差异(R=0.13467,P=0.001)。 2.肠道菌群组成及差异性分析：肠道菌群的群落结构在各组间存在显著差异。Mfuzz聚类发现，在CHB、LC、eHCC、aHCC组间的菌群丰度变化存在一定线性趋势。双歧杆菌属等益生菌随着疾病发展丰度表达逐渐降低；明串珠菌属等有害菌的丰度则随疾病发展逐渐升高。LEfSe分析发现了HBV和HCC组间20个差异物种，其中双歧杆菌属等12种菌属在HBV组中高丰度表达；链球菌属等8种菌属在HCC组中高丰度表达(LDA＞3,P＜0.05)。 3.肠道菌群的细菌表型及功能预测：菌群功能预测发现HBV组富集的通路主要是双歧杆菌分流等；HCC组主要富集的通路为糖质新生等。细菌表型预测结果提示，随着疾病病程变化，细菌生物膜的形成逐渐减少(P＜0.05)，潜在致病性逐渐升高(P＜0.01)，革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的比例也发生了改变，HCC组内的革兰氏阴性菌显著富集(P＜0.01)。 4.粪便代谢产物的差异分析：LC-MS共鉴定出15个可在KEGG数据库中得到注释并找到相关通路的差异代谢物。对比HBV组，琥珀酸、丙酸、二十二碳六烯酸以及Salsolinol等10种代谢物质在HCC组内呈高水平表达；而3-羟基丁酸、反式玉米素(Trans-zeatin)等5种物质的相对表达水平则显著降低。通过KEGG通路富集分析发现，上述显著差异代谢物主要涉及三羧酸循环、不饱和脂肪酸等物质代谢及胆汁酸合成等信号通路。 5.肠道菌群与粪便代谢物的相关性分析：共找到24对显著正相关及44对显著负相关的菌属-代谢物关系。Trans-zeatin与毛螺杆菌属等之间呈显著正相关(P＜0.01)。Salsolinol与Akkermansia之间存在最具统计学意义的相关关系(P＜0.001)。此外，芽孢杆菌等与琥珀酸、丙酸之间存在负相关(P＜0.05)，提示有机酸代谢和菌群的相互作用可能影响了HCC发生发展。 6.特征选择及早期预测模型构建：在LASSO回归初步筛选的基础上建立XGBoost模型，最终选择了4个关键标志菌属，即Akkermansia、Eisenbergiella属、醋杆菌属和伯克霍尔德氏菌-卡巴拉氏菌-拟伯克霍尔德氏菌属。将选择的4个关键标志菌群构建诊断模型，绘制ROC曲线可得AUC=0.94，证明该早期预测模型极高的诊断准确性。 研究结论 1.随着慢乙肝到肝癌的病程发展，肠道菌群的多样性逐渐降低，且存在着阶段性的肠道微生物稳态失调，特定菌属的改变可能与疾病的严重程度存在关联。 2.与健康人相比，患病组的肠道菌群结构发生显著改变，主要表现在肠道内益生菌的丰度下降和致病菌的过度生长。这些变化的菌落可能通过SCFAs、丁酸、LPS代谢及炎症免疫调节等途径加速疾病进程，是乙肝肝硬化肝癌早期诊断的潜在生物标志物。 3.肝癌组中双歧杆菌属的丰度表达下降最为显著，且在亚组间表现出明显的线性趋势，可能通过“双歧杆菌分流”的代谢通路影响短链脂肪酸的生成，从而加速肝癌进展。 4.慢乙肝和肝癌组间显著差异代谢物主要参与涉及了不饱和脂肪酸、胆汁酸、氨基酸等物质代谢及能量代谢等通路。其中琥珀酸、丙酸、二十二碳六烯酸、牛磺胆酸这4种有机酸在肝癌组内表达显著升高，其与肝癌发生发展之间的作用机制亟需深入探索。 5.Trans-zeatin和Salsolinol可能是新发现的肝癌微生物靶点，两者与毛螺杆菌属及Akkermansia之间存在显著相关关系。 6.基于LASSO回归联合XGBoost的机器学习，选择了4个重要分组特征，并构建了一个准确率极高的诊断模型，证实了肠道微生物可作为一种新型无创性筛查工具，在乙肝感染患者中有效识别乙肝肝硬化相关性肝癌的发生。
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