摘要
目的：由各种原因导致的大面积骨缺损仍是临床治疗的一大难题，迫切需要一种较为理想的骨移植物来满足这一临床需求。骨组织工程支架因其良好的理化性能被认为是最具潜力的移植物。近年来，植入物的结构参数如孔的形状、大小和孔隙率等已经被广泛研究，以促进骨组织修复。然而，孔的互联性如何影响支架中骨的生长行为尚不清楚。因此，本研究利用DLP的3D打印技术制备了具有互联性的大孔锌黄长石(HT)支架，然后将硅酸盐生物陶瓷(SrCSi)灌入HT支架，并系统评估了可降解SrCSi生物陶瓷作为大孔网络中的次级相填料对难溶HT生物陶瓷支架的力学和成骨行为的影响，进而为骨组织工程支架的制备提供了新的指引。 方法：分别采用溶胶凝胶法和湿化学共沉淀法合成锌黄长石和5%锶掺杂的硅酸钙(SrCSi)生物陶瓷粉体，并在行星球磨机将其球磨至5μm。使用X射线衍射仪(XRD)和电感耦合等离子光谱仪(ICP-OES)对合成粉体的物相和对应离子含量进行表征分析。使用Magics软件设计了550μm和800μm两种孔径大小的圆柱孔形支架模型(?7×8mm)，并且保持其孔隙率均为50%。利用DLP3D打印技术根据预设的结构模型打印出纯HT多孔支架前体，然后将其在1250℃下烧结2小时得到两种不同孔径的纯HT支架(HT550、HT800)。将10gSrCSi陶瓷粉分散在10ml1.2wt%的羧甲基纤维素溶液中(造孔组用30wt%直径为15μm的聚苯乙烯(PS)微球代替),在真空条件下将其灌注到HT800支架中。干燥后在1150℃下烧结3小时以制备双相复合陶瓷支架(HT800/SrCSi、HT800/SrCSi-P30)。使用扫描电子显微镜(SEM)和高分辨率显微计算机断层扫描来分析支架的微观形貌和孔道几何结构。采用万能试验机来测定四组生物陶瓷支架的抗压强度并计算相应的弹性模量。将支架以1g/50ml的比例浸泡在Tris缓冲液中，以此来评估其在水性介质中离子释放和结构稳定性。为了评价支架的体外仿生再矿化能力将4组支架分别以每0.1cm3/ml的比例浸泡在模拟体液(SBF)中。使用支架浸提液来培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)，并使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和活/死染色来测定细胞的增殖和存活情况。共培养7天后使用蛋白质印迹实验和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)来检测成骨相关蛋白(BMP2、OPN、COL1)和基因(Col1α1、Spp1、Bmp2)的表达。具有不同几何结构的HT基陶瓷支架的体内成骨性能通过兔股骨髁骨缺损模型来评估。将四组陶瓷随机植入32只雄性新西兰大白兔的两侧股骨髁，并在对应的时间点采集标本。采集的标本经X射线初步分析后，使用μCT进行扫描重建，并定量分析BV/TV(新生骨的体积分数)、Tb?N(骨小梁数)等。将固定后的标本切片并进行组织学染色观察，然后使用ImageProPlus6.0软件定量分析，最后，使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)和能量色散X射线光谱仪(EDS)来分析植入支架在体内的物相转变和元素分布。 结果：XRD图谱显示合成的HT和SrCSi陶瓷粉末均符合各自的标准峰，没有其他第二相产生。ICP分析结果显示，SrCSi粉末中Sr含量为4.8%，与理论值接近。支架的大体观察显示，两组纯HT支架都和预设模型一致保持了良好的多孔互联结构，而两组复合支架内部所有孔道均被SrCSi完全填充。支架的实际孔径和孔隙率与理论值接近。SEM图像显示支架的圆柱形孔隙保存完好，复合支架内部可以观察到SrCSi填料。此外，HT800/SrCSi-P30组支架的SrCSi填料中还可以看到PS微球烧结后留下的微孔。体外矿化实验结果表明，与HT陶瓷相比，磷灰石再矿化层更容易沉积到SrCSi的表面。抗压实验结果显示随着孔径的增大支架的抗压强度下降，但都表现出较高的强度(＞21MPa)。值得注意的是SrCSi陶瓷的灌注显著提高了支架的抗压强度和弹性模量。所有支架在浸泡过程中都观察到了离子释放和生物溶解。其中，两组复合陶瓷支架显示出较高浓度的Ca、Si、Sr离子的释放，而HT550支架表现出最低浓度的离子释放。纯HT支架在Tris缓冲液中浸泡8周后显示出极其缓慢的生物降解(质量衰减＜1%)，相比之下，SrCSi填料很容易溶解到水介质中，并产生稳定的质量衰减(质量损失gt;6%)。体外细胞增殖结果表明两组SrCSi填充支架具有更强促进BMSCs增殖能力。活/死染色结果显示大部分细胞均存活，说明支架具有良好的生物相容性。蛋白质印迹和qRT-PCR实验结果显示，SrCSi陶瓷的引入显著提高了成骨相关蛋白(BMP2、OPN、COL1)和基因(Col1α1、Spp1、Bmp2)的表达。碱性磷酸酶(ALP)染色分析显示两组复合支架的ALP表达均高于纯HT支架。在ARS染色中也可以看到类似的结果，其中HT800/SrCSi-P30组的骨矿化密度最高。免疫荧光染色结果也表明SrCSi组份的加入显著提高了OPN的表达。在体内骨修复实验中，所有兔子均存活至对应的标本采集时间点。标本的X射线图像显示，随着植入时间延长，各组的材料-骨组织界面逐渐模糊，这表明新骨组织的生长和整合达到了预期。μCT重建图像显示，在4周时，两组复合支架均表现出明显的新骨生长受阻，然而，随着SrCSi填料的逐渐降解，其成骨能力显著增强。尤其是HT800/SrCSi-p30组，到16周时，BV/TV已经超过32%，明显高于其他支架。值得一提的是此时其内部的SrCSi填料也已经完全降解。组织学染色结果表明，在植入早期两组纯HT支架显示出更高的新骨长入，然而随着植入时间的延长，HT800/SrCSi-P30组的新骨长入明显增加。16周后其新骨组织已经与宿主骨完全桥接。SEM-EDS检测结果显示，在植入支架促进骨修复的过程中，新骨组织和类磷灰石层在支架内部不断沉积。 结论：本研究采用数字光处理(DLP)工艺制备了具有不同孔径(550μm、800μm)的HT支架。然后通过将高度可生物降解的SrCSi陶瓷作为次级相填充到800μm孔径的HT支架内，从而开发了一种具有精确可控组分分布的双相复合生物陶瓷支架。结果表明，SrCSi填充的HT基复合陶瓷支架不仅具有显著的抗压强度和弹性模量，还表现出明显的生物活性和成骨性能。这些发现提供了一些新的见解，即孔隙的相互连接性并不会随着植入时间的延长而不可避免地阻碍骨的生长，这种高生物降解性和生物活性的填料侵入策略可能有利于优化支架在骨再生医学应用中的性能。
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