摘要
目的： 优选酒黄芩、酒蜜黄芩的最佳微波炮制工艺，筛选出加酒量、酒蜜比、闷润时间、微波功率、微波时间最佳参数，创新黄芩的炮制工艺。建立生制品指纹图谱，研究生品黄芩、微波酒黄芩、微波酒蜜黄芩对急性肝损伤(Acute liver injury，ALI)小鼠的药效学作用机制。通过对黄芩炮制前后化学成分变化及药效学的作用研究，探讨黄芩炮制机理。在2020年版《中国药典》的基础上，对微波炮制前后的黄芩的各项检测指标进行补充，建立生品黄芩、微波酒黄芩、微波酒蜜黄芩、传统酒黄芩的质量标准，为黄芩临床合理应用及炮制工艺研究提供理论基础。 材料与方法： 材料： 收集不同产地的黄芩原药材，产地来源为辽宁省，四川省，陕西省，山东省等地，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根。 方法： 1.多指标综合评价结合层次分析法优化黄芩微波酒制工艺 通过单因素实验确定最佳的加酒量、闷润时间、微波功率、微波时间，将黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量进行加权评分作为评价指标，综合运用层次分析法和正交实验的方法来筛选出黄芩最佳微波酒制工艺。 2.多指标综合评价结合层次分析法优化黄芩微波酒蜜炮制工艺 通过单因素实验确定最佳的酒蜜比、闷润时间、微波功率、微波时间，将黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量进行加权评分作为评价指标，综合运用层次分析法和正交实验的方法来筛选出黄芩最佳微波酒蜜制工艺。 3.基于HPLC指纹图谱的不同产地黄芩炮制前后化学成分研究 收集10批不同产地的黄芩原药材，按照上述最佳炮制工艺炮制，得到黄芩生品、微波酒黄芩，微波酒蜜黄芩；采用高效液相色谱法，建立指纹图谱分析方法，进行不同产地黄芩的相似度评价，并进行多元统计分析，为黄芩药材质量控制提供理论依据。 4.黄芩及其炮制品通过抑制MyD88/NF-κB通路保护LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤 将80只雄性昆明小鼠随机分为8组，每组10只，包括：正常组、模型组、阳性药物组(联苯双酯组)、黄芩生品组、微波酒黄芩组、微波酒蜜黄芩组、辅料酒组、辅料酒蜜组。各给药组小鼠每天按照体重，灌胃给药1次，正常组和模型组灌胃生理盐水，连续给药7d，末次给药1h后，除正常组腹腔注射生理盐水外，其余各组腹腔注射LPS(30μg·kg-1)和D-GalN(500 mg·kg-1)，建立急性肝损伤模型。模型建立后，禁食不禁水，观察小鼠状态，6h后，进行药理实验，记录小鼠肝脏重量，计算小鼠脏器指数；苏木素-伊红(HE)染色法观察肝组织病理学变化；ELISA法检测小鼠血清ALT、AST、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的含量；检测肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的水平；应用Westernblot和PCR法检测肝脏组织中NF-κBp65、MyD88蛋白的表达及NF-κBp65、MyD88、TNF-α、IL-6mRNA水平的表达。 5.黄芩、微波酒黄芩、微波酒蜜黄芩、传统酒黄芩质量标准研究 在优化所得黄芩最佳微波酒制，微波酒蜜制工艺的基础上，建立黄芩及其炮制品的质量标准，参照2020年版《中国药典》黄芩项下的各项质量控制指标，对黄芩及其炮制品的外观性状、显微特征进行鉴别；对水分、总灰分、酸不溶性灰分等杂质项进行检查；对醇溶性浸出物含量进行测定；对黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量进行测定。 结果： 1.多指标综合评价结合层次分析法优化黄芩微波酒制工艺 通过正交实验优选的黄芩微波酒制工艺为：取生黄芩饮片适量，加入药材质量10%的辅料黄酒，置于密闭容器内闷润30min，在300W功率下微波5min。 2.多指标综合评价结合层次分析法优化黄芩的微波酒蜜炮制工艺 通过正交实验优选的黄芩微波酒蜜制工艺为：取生黄芩饮片适量，加入药材质量25%的酒蜜混合辅料(酒蜜比为10∶15)，置于密闭容器内闷润60min，在300W功率下微波3min。 3.基于HPLC指纹图谱的不同产地黄芩炮制前后化学成分研究 黄芩10个不同产地的生品及微波酒黄芩，微波酒蜜黄芩，相似度均高于0.983，此外，生品共有峰有10个，微波酒黄芩共有峰有16个，微波酒蜜黄芩共有峰有15个，各共有峰之间的分离度良好。 4.黄芩及其炮制品通过抑制MyD88/NF-κB通路保护LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤 黄芩及其炮制品预处理可不同程度减轻小鼠肝组织病理损伤；与空白组相比，模型组ALT、AST、IL-6、TNF-α、MDA水平明显升高(Plt;0.01)，SOD水平明显降低(Plt;0.01)，表明小鼠急性肝损伤模型建立成功；与模型组相比，阳性药组、生品黄芩、微波酒黄芩、微波酒蜜黄芩组均可抑制由LPS/D-GalN诱导的ALT、AST、IL-6、TNF-α、MDA的产生及SOD的降低(Plt;0.05)；辅料酒和辅料酒蜜组无明显治疗作用(Pgt;0.05)。黄芩及其炮制品可以激活MyD88/NF-κB信号通路，可不同程度抑制MyD88、NF-κBp65蛋白表达及MyD88、NF-κBp65、IL-6、TNF-αmRNA的表达。 5.黄芩、微波酒黄芩、微波酒蜜黄芩、传统酒黄芩质量标准研究 显微和薄层鉴别结果显示：生品黄芩、微波酒黄芩、微波酒蜜黄芩、传统酒黄芩均符合药典标准；水分检查项：生品黄芩、传统酒黄芩不得过12.0%，微波酒黄芩、微波酒蜜黄芩均不得过11.0%；总灰分检查项：生品黄芩、微波酒黄芩、微波酒蜜黄芩、传统酒黄芩不得过6.0%；酸不溶性灰分检查项：生品及其炮制品均不得过3.0%；醇溶性浸出物检查项：生品黄芩不得少于40.0%，微波酒黄芩不得少于43.0%，微波酒蜜黄芩不得少于44.0%，传统酒黄芩不得少于42.0%；含量测定项：生品黄芩拟定为“黄芩苷含量不得低于8.0%，汉黄芩苷含量不得低于3.0%，黄芩素含量不得低于1.0%，汉黄芩素含量不得低于0.1%，4种化合物总量不低于12.0%”；微波酒黄芩拟定为“黄芩苷含量不得低于9.0%，汉黄芩苷含量不得低于3.0%，黄芩素含量不得低于2.0%，汉黄芩素含量不得低于0.2%，4种化合物总量不低于15.0%”；微波酒蜜黄芩饮片拟定为“微波酒蜜黄芩中黄芩苷含量不得低于10.0%，汉黄芩苷含量不得低于4.0%，黄芩素含量不得低于2.0%，汉黄芩素含量不得低于0.3%，4种化合物总量不低于16.0%”；对应传统酒黄芩饮片拟定为“传统酒黄芩中黄芩苷含量不得低于9.0%，汉黄芩苷含量不得低于3.0%，黄芩素含量不得低于2.0%，汉黄芩素含量不得低于0.2%，4种化合物总量不低于14.0%”。 结论： 1.采用正交实验结合多指标综合加权评分法筛选出微波酒黄芩炮制工艺，该工艺不仅缓和了黄芩的苦寒之性，而且提高了酒黄芩的质量，且优化所得工艺稳定，重复性良好为饮片工业规范化生产提供理论依据。 2.采用正交实验结合多指标综合加权评分法筛选出微波酒蜜黄芩炮制工艺，借助黄酒的热性来缓和黄芩的寒凉之性，经由蜜制，调和黄芩的偏性，制约药物的副作用。研究结果显示，采用酒蜜双辅料炮制的黄芩中总黄酮类化合物的溶出度增加。优化所得工艺稳定，重复性良好为饮片工业规范化生产提供理论依据。 3.建立的HPLC指纹图谱的特征性良好，可用于黄芩及其炮制品的质量控制。 4.黄芩及其炮制品均可通过抑制氧化应激和炎症反应缓解LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤，作用机制与激活MyD88/NF-κBp65信号通路、抑制NF-κBp65、MyD88蛋白和NF-κBp65、MyD88、TNF-α、IL-6基因水平表达、抑制炎症因子释放有关，其中微波酒蜜黄芩治疗效果最好。 5.在2020年版《中国药典》黄芩饮片的各项质量标准基础上，对黄芩生品、微波酒黄芩、微波酒蜜黄芩、传统酒黄芩的性状、显微、薄层、水分、总灰分、浸出物以及含量测定等指标进行了进一步的完善，含量测定项中，增加了汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量作为指标成分，可更好的规范黄芩的炮制工艺，从而实现对黄芩饮片的治疗控制，以及对临床用药安全的把控。
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