摘要
目的： 本研究旨在探索桃红四物汤与二甲双胍乳膏联合用药对小鼠皮肤光老化的影响。基于桃红四物汤已知的抗光老化功效，结合NF-κB炎症信号通路，通过动物实验考察联合用药的效果。这一研究方案的制定旨在充分发挥中西医结合的优势，探讨联合用药是否能取得比单一用药更好的效果。本研究的结果有望为克服皮肤光老化问题提供新的方向和理论支持。 材料与方法： 1．实验动物分组、造模和评分：将60只同种系SPF级健康KM雌鼠，随机分为空白组、模型组、维生素E组(简称VE组)、桃红四物汤组、二甲双胍乳膏组、桃红四物汤联合二甲双胍乳膏组(简称联合用药组)，共6组，每组10只。照射前，先对小鼠背部皮肤进行剃毛，暴露部分大小约为3cm×4cm，每3天剃一次毛。自适应1周后，除空白组外，其余各组小鼠自第2周开始均采用紫外线灯管照射构建光老化小鼠模型。照射前提前打开灯管预热15min，使照射强度具有均一性和稳定性。第2~4周每次照射时间分别为20、40、60min，自第5周开始每次照射80min，每周按固定时间照射3次，总照射时长为12周。造模成功的第二天，开始给予各组小鼠相应的药物持续干预30d。给药结束后使用相机拍摄记录小鼠皮肤的变化情况，观察、对比组间的差异并对皮肤光老化程度进行肉眼评分，评分越高则光损伤越严重。实验全程注意观察并记录小鼠的一般情况和皮肤变化情况。 2．检测指标：给药结束后，取下小鼠眼球血和皮肤组织。采用HE染色法(苏木素-伊红染色)观察光老化小鼠皮肤组织形态；采用ELISA(酶联免疫吸附法)检测小鼠血清中PGE2的表达水平；采用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)检测小鼠皮肤组织中COX-2mRNA表达含量；采用Western-blot(蛋白免疫印迹法)检测小鼠皮肤组织中p-NF-κB、p-NF-κBp65、COX-2的蛋白表达含量。 3．统计学方法：检测结束后，使用SPSS26.0进行统计分析。所得数据呈现正态分布，采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。统计结果以均数±标准差(?x±s)表示。 结果： 1.小鼠一般情况：空白组小鼠无不良反应，活动自由，并且皮肤细腻有光泽，一般情况良好；造模成功后观察发现小鼠身体蜷缩呈困倦状态，肉眼观察发现模型组小鼠的皮肤出现光老化的表现：皮肤色泽不均匀、褶皱起皮、粗糙、干燥，纹理粗大而深厚，颜色暗红，皮肤外观呈皮革样改变。与模型组相比，各给药组小鼠皮肤光老化的表现均有了不同程度的改善。其中，联合用药组改善效果最佳，皮肤外观最接近于空白组。 2.小鼠皮肤光老化损伤评分：各组小鼠评分结果经统计分析后得出，相较于空白组，模型组的评分明显变高(P＜0.05)；与模型组相比，VE组、桃红四物汤组、二甲双胍乳膏组小鼠的皮肤光老化评分较小，皮肤老化得到了不同程度的缓解，并且缓解程度最大的是联合用药组(P＜0.05)。 3.HE染色法：HE染色发现空白组小鼠皮肤的表皮层结构清晰，无异常增厚，真皮层内胶原纤维丰富，排列有序，分布均匀，形状似细波浪，表皮层和真皮层连接处纤维结构排列有序；模型组小鼠背部皮肤经过紫外线照射后，角质层出现异常增生，表皮层厚度明显增加，真皮内胶原纤维断裂，排列疏松，真皮浅层出现血管扩张；与模型组相比，各用药组上述情况均得到了不同程度的改善；与VE组、桃红四物汤组、二甲双胍乳膏组相比，联合用药组HE切片中皮肤角化过度的情况得到明显改善，皮肤表皮层厚度最接近正常，真皮层的纤维最多且排列致密，真皮浅层血管稍微扩张，皮肤结构更接近于空白组。 4.ELISA：酶联免疫吸附法检测得出，与空白组相比，模型组PGE2的表达含量明显升高(P＜0.05)；与模型组相比，VE组、桃红四物汤组和二甲双胍乳膏组PGE2的表达水平均出现了不同程度的下降(P＜0.05)；相较于VE组、桃红四物汤组、二甲双胍乳膏组，联合用药组PGE2的表达含量出现显著下降(P＜0.05)。 5.RT-PCR：与空白组相比，模型组COX-2mRNA表达含量明显升高(P＜0.05)；与模型组相比，各用药组COX-2mRNA表达含量均出现下降(P＜0.05)；相较于VE组、桃红四物汤组和二甲双胍乳膏组，联合用药组COX-2mRNA表达含量出现显著下降(P＜0.05)。 6.Western-blot：与空白组相比，模型组p-NF-κB、p-NF-κBp65、COX-2的蛋白表达含量明显升高(P＜0.05)；与模型组相比，各用药组p-NF-κB、p-NF-κBp65、COX-2的蛋白表达含量明显降低(P＜0.05)；相较于VE组、桃红四物汤组和二甲双胍乳膏组，联合用药组p-NF-κB、p-NF-κBp65、COX-2的蛋白表达含量出现显著下降(P＜0.05)。 结论： 1．桃红四物汤和二甲双胍乳膏能够减轻小鼠皮肤炎症反应，从而起到改善皮肤光老化的效果。 2．联合用药组改善皮肤光老化的效果优于其他单一用药组。 3．NF-κB炎症信号通路的激活是紫外线辐照皮肤产生光老化的重要机制；桃红四物汤联合二甲双胍乳膏治疗皮肤炎症和光老化的机制可能是通过抑制NF-κB信号通路的激活从而起到抗炎作用来完成的。
NETL