摘要
目的： 枳实始载于汉代《神农本草经》，历代古籍中记载有：“清炒、麸炒、土炒、面炒、炒炭、酒炙、醋炙、蜜炙、姜炙”等多种炮制方法，但在复方中枳实生、制品滥用情况比较严重，从而直接影响了中药复方的临床疗效。因此，课题以经方枳实芍药散为研究对象，通过对生、制枳实换用的枳实芍药散挥发性成分的组成、主要活性成分的含量及药代动力学行为的比较，同时结合相关药效学研究，明确枳实芍药散应在方中使用生枳实还是制枳实入药，从而深入解析枳实的炮制机理。 材料与方法： 材料： 枳实饮片和白芍药材分别购于江西省和安徽省，经辽宁中医药大学王荣祥教授鉴定为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥幼果和毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根。麦麸(批号：160801)购于安徽省，符合2020版《中国药典》标准。 方法： 1.生、制枳实换用的枳实芍药散的化学成分研究 (1)生、制枳实换用的枳实芍药散的挥发性成分比较研究：采用静态顶空进样-气质联用(HS-GC-MS)技术结合保留指数法对生、制枳实换用的枳实芍药散及辅料生、制麦麸的挥发性成分进行定性鉴定。同时，利用SIMCA-P软件，采用多元统计分析方法，通过主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，寻找生、制枳实换用的枳实芍药散以及生、制麦麸间挥发性成分的差异，从挥发性成分变化的角度初步探究枳实芍药散中用生、制枳实的炮制机理。 (2)生、制枳实换用的枳实芍药散主要活性成分的定量研究：采用高效液相色谱(HPLC)技术，对生、制枳实换用的枳实芍药散及组方单味药饮片中的主要活性成分进行定量分析。以辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、没食子酸、(+)-儿茶素、芍药苷和芍药内酯苷9个活性成分为指标，从主要活性成分变化的角度解析枳实芍药散中用生、制枳实的炮制机理。 2.生、制枳实换用的枳实芍药散的药动学研究 (1)生、制枳实换用的枳实芍药散血浆药动学研究：采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UPLC-QqQ-MS)技术，测定生、制枳实换用的枳实芍药散中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、芍药苷7种成分24h内不同时间点大鼠血浆中的含量，并比较7种成分在体内吸收入血情况的差异，从指标性成分在体内的药动学行为角度解析枳实芍药散中用生、制枳实的炮制机理。 (2)生、制枳实换用的枳实芍药散排泄动力学研究：采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UPLC-QqQ-MS)技术，测定生、制枳实换用的枳实芍药散中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、芍药苷7种成分在大鼠尿液及粪便中的含量，并进行排泄动力学的比较研究，从指标性成分在体内排泄的角度解析枳实芍药散中应用生、制枳实的炮制机理。 3.生、制枳实换用的枳实芍药散的药效学研究 (1)基于网络药理学探讨复方枳实芍药散治疗IBS的作用机制：利用中药系统药理学数据库与分析平台数据库(TCMSP)，按照口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18条件并结合文献研究筛选出复方枳实芍药散中两味中药的活性成分，结合SwissTargetPrediction数据库获取活性成分的作用靶点。通过GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB和DrugBank数据库收集肠易激综合征的疾病靶点。取活性成分靶点和肠易激综合征疾病靶点的交集，得到复方枳实芍药散治疗肠易激综合征的潜在靶点。利用String数据库构建蛋白质-蛋白质互作网络和Metascape平台进行靶点GO富集分析和KEGG富集分析，通过Cytoscape3.9.1软件构建“中药-活性成分-疾病-潜在靶点-通路”网络并进行分析，从网络药理学的角度初步揭示枳实芍药散治疗肠易激综合征(IBS)的作用机制。 (2)生、制枳实换用的枳实芍药散对C-IBS大鼠血清中脑肠肽水平的影响：采用0~4℃冰0.9%氯化钠溶液灌胃的方法建立C-IBS大鼠模型，检测粪便含水量评价模型是否复制成功。灌胃给予生、制枳实换用的枳实芍药散的提取物，末次给药结束后检测小肠推进率，腹主动脉取血，ELISA法检测大鼠血清中5-HT、VIP、NPY、CGRP、SP的水平。 (3)基于VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路探讨生、制枳实换用的枳实芍药散调控C-IBS大鼠的作用及机制：末次给药后禁食不禁水12h，腹主动脉取血，ELISA法检测大鼠血浆中DAO、D-LA的水平；取结肠组织约1cm，苏木素-伊红染色观察结肠组织病理损伤变化；另取一段结肠迅速分装于EP管，于液氮中速冻后，用于荧光定量PCR检测cAMP、PKA、AQP3mRNA的表达及Western-Blot检测VIP、AQP3蛋白的表达。 (4)生、制枳实换用的枳实芍药散对C-IBS大鼠SCFAs含量的影响：末次给药后禁食不禁水12h，采用提尾反射法取各组大鼠粪便样本于无菌EP管中，于液氮中速冻后，采用气质联用色谱法(GC-MS)检测短链脂肪酸含量的变化。 结果： 1.生、制枳实换用的枳实芍药散的化学成分研究 (1)生、制枳实换用的枳实芍药散的挥发性成分比较研究：通过质谱匹配和保留指数法分别从生枳实芍药散、清炒枳实芍药散、麸炒枳实芍药散、炒炭枳实芍药散、生麦麸、麸炒枳实后麦麸、白芍中鉴定出39、34、32、38、27、24、30种，共87个成分，包括烯烃类、羧酸类、醛酮类、醇类、酚类、醚类、酯类、含杂原子类等成分。通过化学计量学的方法，比较了生、制枳实换用的枳实芍药散及生、制麦麸炮制前后的化学成分组成，发现与生枳实入药的枳实芍药散比较，清炒枳实入药的枳实芍药散有9种成分未检出，新增了4种成分，麸炒枳实入药的枳实芍药散有9种成分未检出，新增了2种成分，炒炭枳实入药的枳实芍药散有17种成分未检出，新增了16种成分。麸炒枳实后麦麸有15种成分未检出，新增了11种成分。 (2)生、制枳实换用的枳实芍药散主要活性成分的定量研究：对比枳实炮制及组方白芍后黄酮苷类成分含量发现，单味药和复方中枳实经清炒和麸炒后柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量均增加，而炒炭之后黄酮苷类成分均显著降低，复方与单味药白芍相比，芍药内酯苷、没食子酸、(+)-儿茶素的含量均增加，在比较生、制枳实入药的枳实芍药散之间，清炒枳实入药的枳实芍药散中芍药苷和(+)-儿茶素的含量明显高于其他枳实入药的枳实芍药散，而芍药内酯苷和没食子酸的含量在炒炭枳实入药的枳实芍药散中含量最高。 2.生、制枳实换用的枳实芍药散的药动学研究 (1)生、制枳实换用的枳实芍药散血浆药动学研究：大鼠灌胃给予生、制枳实换用的枳实芍药散提取物后，相比于生枳实入药的枳实芍药散，清炒枳实入药的枳实芍药散大鼠血浆中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均有不同程度的降低，芸香柚皮苷、柚皮苷的t1/2略有延长，新橙皮苷、柚皮素、橙皮素的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均有不同程度的升高，t1/2略有延长；麸炒枳实入药的枳实芍药散大鼠血浆中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素在大鼠体内的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞显著升高，t1/2显著延长，Tmax略有所短，橙皮素的Cmax显著升高、AUC0-t、AUC0-∞显著降低，t1/2显著延长；炒炭枳实入药的枳实芍药散大鼠血浆中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在大鼠体内的Cmax显著降低，柚皮素和橙皮素的Cmax也呈下降的趋势；芍药苷在灌胃生、制枳实入药的枳实芍药散后体内药动学参数没有明显的差异。 (2)生、制枳实换用的枳实芍药散排泄动力学研究：大鼠灌胃给予生、制枳实换用的枳实芍药散提取物后，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷4种成分的排泄特征接近，累计排泄率较小，主要集中在0-12h，且在6-9h排泄速率最快；柚皮素和橙皮素的排泄特征相似，累计排泄率均较高，0-3h的排泄速率较快，芍药苷约有1%以原型药物经尿液和粪便排出，且芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及芍药苷在粪便中的排泄率高于尿液中的排泄率，而柚皮素和橙皮素在尿液中的排泄率高于粪便中的排泄率。相比于生枳实入药的枳实芍药散，清炒枳实和麸炒枳实入药的枳实芍药散的尿液及粪便累计排泄率升高，且麸炒枳实入药的枳实芍药散更为明显。 3.生、制枳实换用的枳实芍药散的药效学研究 (1)基于网络药理学探讨复方枳实芍药散治疗IBS的作用机制：从枳实芍药散中筛选得到34个化合物及628个作用靶点，与1419个IBS疾病靶点取交集得到123个作用靶点，PPI网络分析SRC、PIK3R1、HRAS、PIK3CA、MAPK1等可能是复方枳实芍药散治疗肠易激综合征的重要靶点。靶点基因富集的蛋白功能主要包括对MAPK级联调节、运动的正向调节、炎症反应等；涉及的主要通路包括神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、cAMP信号通路等。 (2)生、制枳实换用的枳实芍药散对C-IBS大鼠血清中脑肠肽水平的影响：与空白组比较，模型组大鼠粪便含水量、小肠推进率明显降低(Plt;0.01)，说明模型复制成功，大鼠血清中的5-HT、VIP、CGRP、SP水平显著上升，NPY水平显著下降(Plt;0.01)；与模型组比较，各给药组大鼠血清中5-HT、VIP、CGRP和SP水平均有不同程度的降低，NPY水平升高(Plt;0.05，Plt;0.01)，相同剂量下，麸炒枳实入药的枳实芍药散组的作用优于生枳实入药的枳实芍药散组。 (3)基于VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路探讨生、制枳实换用的枳实芍药散调控C-IBS大鼠的作用及机制：与空白组比较，模型组大鼠血浆中DAO和D-LA水平明显升高(Plt;0.01)，结肠组织黏膜上皮轻度破损，杯状细胞减少且腔内颗粒明显减少，结肠组织中AQP3、cAMP、PKAmRNA表达水平和AQP3、VIP蛋白表达水平显著下降(Plt;0.05，Plt;0.01)；与模型组比较，各给药组均能下调DAO和D-LA水平(Plt;0.05， Plt;0.01)，改善黏膜损伤，提高杯状细胞数量及腔内细胞颗粒，升高C-IBS模型大鼠结肠组织中AQP3、cAMP、PKAmRNA以及VIP、AQP3蛋白的表达水平(Plt;0.05，Plt;0.01)，且麸炒枳实入药的枳实芍药散组的效果最佳。 (4)生、制枳实换用的枳实芍药散对C-IBS大鼠SCFAs含量的影响：与空白组比较，模型组大鼠粪便中7种短链脂肪酸总量呈明显下降趋势，其中，乙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸、己酸5种短链脂肪酸含量显著减少，丙酸、丁酸2种短链脂肪酸含量显著上升(Plt;0.05，Plt;0.01)，经药物干预后发现，各样本中SCFAs受各给药组调节的范围和强度略有不同，除异丁酸外各给药组对大鼠粪便中短链脂肪酸含量均具有显著回调作用，并且麸炒枳实入药的枳实芍药散的作用稍强于其他炮制品枳实入药的枳实芍药散(Plt;0.05，Plt;0.01)。 结论： 1.枳实芍药散中枳实的炮制及配伍过程对化学成分存在明显的量变及质变规律，挥发性成分间的主要差异性成分为萜烯类和醛酮类化合物。 2.生、制枳实换用的枳实芍药散中指标性成分的血浆药动学及排泄动力学特征存在明显差异，麸炒枳实入药的枳实芍药散更有利于指标性成分在大鼠体内的吸收，促进上述成分从尿液及粪便排出，从而减少对胃肠道的刺激和对肾脏的损害。 3.生、制枳实换用的枳实芍药散均可以通过调节模型动物的胃肠动力及胃肠黏膜屏障功能，纠正脑肠肽(神经递质及胃肠激素)水平，调控短链脂肪酸含量以及VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路，从而改善C-IBS的临床症状，且麸炒枳实入药的枳实芍药散具有更好的治疗效果。
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