摘要
Cyr61是哺乳动物CCN家族分泌基质细胞蛋白的一员，由4个结构域构成，可以与多种信号因子产生特异性结合，在不同的生理、病理条件下拥有多种生物学功能。但由于该蛋白富含半胱氨酸，极易形成包涵体，目前关于Cyr61蛋白的纯化研究仍未获得理想结果。本研究利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统，进行了Cyr61重组蛋白的表达鉴定，并尝试利用真核细胞的后加工特性来获得有活性的Cyr61重组蛋白，为进一步开展Cyr61蛋白的功能研究提供材料。研究结果如下： 1．成功构建重组杆粒 使用 Bac-to-Bac 表达系统，首先克隆出目的基因 Cyr61 并整合至杆状病毒表达载体获得重组质粒 pFastBacHTB-Cyr61。将重组质粒分别转化至含有 BmNPV 和AcMNPV的DH10Bac感受态细胞株中发生转座，成功获得2种重组杆粒，分别命名为pBm-Bacmid-Cyr61和pAc-Bacmid-Cyr61。 2．Cyr61重组蛋白在BmⅥ细胞和Sf9细胞中成功表达 利用转染试剂介导将 2 种重组杆粒分别转染 BmⅥ和 Sf9 细胞获得重组杆状病毒，通过空斑纯化得到纯化后的重组病毒。多次感染细胞以提高重组病毒的滴度，进一步大量感染宿主细胞获得重组目的蛋白 Cyr61。通过 SDS-PAGE 和 Western blot 对蛋白表达产物进行鉴定，结果表明Cyr61蛋白在2种昆虫细胞中均成功表达。 3．Cyr61重组蛋白在BmⅥ、Sf9细胞和蚕蛹中表达量的比较 使用感染重组病毒的 BmⅥ、Sf9 细胞和家蚕蚕蛹进行 Western blot 鉴定并计算灰度值，结果显示在Sf9细胞中Cyr61蛋白得到大量表达，约为BmⅥ细胞中表达量的3倍，而蚕蛹中目的蛋白表达量极低，在3个表达系统中Cyr61蛋白表达量差异显著。 4．重组蛋白Cyr61的分离和纯化探究 采用表达效率较高的Sf9表达系统大量诱导目的蛋白表达，利用5种改良后的细胞裂解液进行细胞裂解并验证目的蛋白的溶解性，结果表明其中2种裂解液对Cyr61蛋白溶解效果较好，但由于Cyr61重组蛋白的包涵体特性，利用Ni-NTA柱纯化His-Cyr61融合蛋白时未发生特异性结合，导致未获得良好的纯化结果。 综上所述，本研究运用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统，成功地在BmⅥ和Sf9细胞中表达Cyr61重组蛋白，并对Cyr61重组蛋白的溶解性与纯化方案进行了初步探究，为今后Cyr61重组蛋白的进一步纯化与临床检验诊断应用奠定了坚实的基础。
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