摘要
研究目的 激素受体阳性乳腺癌是所有乳腺癌分子类型中占比例最大，约达80%左右。CDK4/6抑制剂（CDK4/6i)为激素受体阳性的晚期乳腺癌患者带来了较好的临床获益，但部分患者最终因原发性或获得性CDK4/6i耐药而导致治疗的失败。课题组的工作一直致力于乳腺癌耐药方面的研究。首次发现在CDK4/6i耐药的乳腺癌细胞中PARP1显著上调，推测PARP1可能参与乳腺癌对CDK4/6i耐药。然而，耐药过程中乳腺癌细胞是如何调控PARP1的表达有待进一步的研究。本课题的主要目的是证实PARP1是乳腺癌对CDK4/6i耐药的关键基因；其表达的上调可能是通过YB1的磷酸化。鉴于“p-YB1-PARP1”通路在乳腺癌对CDK4/6i耐药中的重要作用，进一步研发该通路相关的抑制剂来逆转耐药发生，改善患者预后。 研究方法 1.本论文通过构建乳腺癌细胞CDK4/6i耐药株模型，经过6个月的药物压力筛选，获得了MCF7AR耐药株。通过Westernblot检测乳腺癌敏感株MCF7及耐药株MCF7AR中PARP1的表达量。 2.在耐药株中敲低PARP1或者使用PARP1抑制剂Olaparib，通过CCK8检测细胞活力、药物杀伤实验、流式检测细胞凋亡率来证实PARP1上调是CDK4/6i耐药中的关键因素。 3.在高表达PARP1细胞系以及耐药株中使用p-YBl抑制剂LJI308，通过Westernblot检测细胞内PARP1蛋白水平的变化以及对CDK4/6i敏感性水平的变化。进一步确定“p-YB1-PARP1”通路在CDK4/6i耐药中的作用。 4.通过构建YB1蛋白Ser102位的突变质粒，来探讨YB1蛋白Ser102的磷酸化在CDK4/6i耐药中的作用。 5.同时给予荷瘤小鼠CDK4/6i和“p-YB1-PARP1”通路相关抑制剂，确定二者是否发挥协同抗肿瘤效应。 6.通过收集各个类型的乳腺癌临床样本，检测PARP1和p-YBl水平的相关性，综合分析“p-YB1-PARP1”的表达和CDK4/6i敏感性之间的关联。 实验结果 1.在MCF7AR耐药株中发现PARP1水平显著高于MCF7敏感株。 2.在耐药株中敲低PARP1或者使用PARP1抑制剂Olaparib，发现能够恢复细胞对CDK4/6i的敏感性。 3.在高表达PARP1细胞系以及耐药株中使用p-YBl抑制剂LJI308，发现细胞内PARP1蛋白水平逐渐下调。CHIP实验结果显示YB1能富集在PARP1基因的启动子区域，同时发现LJI308的应用也能够恢复细胞对CDK4/6i的敏感性。因此我们提出“p-YB1-PARP1”通路在CDK4/6i耐药中可能发挥着重要作用。 4.我们通过构建YB1蛋白Ser102位的突变质粒，发现YB1蛋白Ser102位的磷酸化能够影响CDK4/6i耐药和调控PARP1的表达。 5.我们在裸鼠的荷瘤模型上，使用CDK4/6i和“p-YB1-PARP1”通路相关抑制剂，发现两者联合应用能够发挥协同抗肿瘤效果。 6.最后发现在乳腺癌各个分子类型中p-YBl和PARP1表达水平呈正相关，并且可能和CDK4/6i敏感性有关。 结论 1.MCF7AR耐药株中高表达PARP1。 2.PARP1抑制够恢复CDK4/6i敏感性，提示PARP1可能是乳腺癌对CDK4/6i耐药的关键基因。 3.YB1蛋白Ser102位的磷酸化可能通过调控PARP1水平来介导CDK4/6i耐药。
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