摘要
目的: 本研究立足于HIF-1ɑ/糖酵解-成纤维细胞活化轴探讨三芪口服液改善肾脏纤维化,延缓慢性肾脏病进展的作用和机制,进一步阐释三芪口服液治疗慢性肾脏病的现代科学内涵. 方法: 动物实验研究采用了5/6肾切除的CKD大鼠模型,大鼠5/6肾切除术后2周大鼠眼眶采血评估CKD模型构建情况,根据血肌酐结果进行随机分组,分为:Sham组(Sham)、模型组(Model)、三芪口服液低剂量组(SQ1X)、三芪口服液高剂量组(SQ2X).三芪口服液治疗组大鼠予每日1次的三芪口服液灌胃给药,连续3个月.给药结束后收集大鼠24小时尿液检测尿蛋白定量及尿蛋白肌酐比,随后安乐死大鼠并收集腹主动脉血、肾脏组织.检测大鼠血肌酐、胱抑素C、尿素氮、白蛋白、血清乳酸、丙酮酸和肾组织匀浆乳酸、丙酮酸水平明确肾功能、能量代谢情况;肾组织病理切片行HE染色、马松染色、PAS染色评估肾脏病理损伤情况;免疫组化联合蛋白印迹法检测ɑ-SMA、Vimentin、PCNA蛋白和通路关键蛋白缺氧诱导因子-1 alpha(HIF-1ɑ)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、已糖激酶2(HK2)表达水平;聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测HIF-1ɑ、PKM2、ɑ-SMA、Vimentin的mRNA水平,明确肾脏HIF-1ɑ/糖酵解-成纤维细胞活化情况. 细胞实验首先构建了TGF-β1诱导NRK-49F细胞(大鼠肾成纤维细胞)活化模型,通过CCK-8、免疫荧光联合蛋白印迹法分析不同浓度TGF-β1和(或)三芪口服液冻干粉(SQ)干预后NRK-49F细胞增殖情况,确定TGF-β1和SQ最佳干预浓度;Seahorse XFe24 细胞能量代谢检测系统动态检测质子流出速率(PER)、基础糖酵解和补偿性糖酵解水平;蛋白印迹法检测HIF-1ɑ、PKM、HK2蛋白表达情况;RT-qPCR法检测 HIF-1ɑ、PKM2、ɑ-SMA、Vimentin mRNA 水平,明确 SQ 对 HIF-1ɑ/糖酵解-成纤维细胞活化的调控作用.进一步采用siRNA技术对HIF-1ɑ基因进行沉默,进一步验证NRK-49F细胞中HIF-1ɑ基因沉默后,SQ对TGF-β1诱导NRK-49F细胞活化的抑制作用是否明确减弱. 成果: 首先,在动物实验部分,给予连续3个月的SQ干预后,与5/6肾切除Model组,三芪口服液给药组大鼠血清肌酐、胱抑素C、尿素氮、白蛋白及24小时尿蛋白及尿蛋白肌酐比水平出现不同程度的改善,特别是SQ2X组的胱抑素C、尿素氮水平显著下降(P＜0.05).HE染色、Masson染色及PAS染色结果显示Model组大鼠肾组织出现明显肾小管损伤变性,出现肾小管萎缩,管腔增大,管腔内可见组织碎片及透明管型,伴有明显的肾小管间质纤维化.SQ2X组大鼠肾组织的以上情况均得到改善.肾组织免疫组化联合蛋白印迹法结果显示,对比Sham组,Model组大鼠肾组织HIF-1ɑ、PKM2、ɑ-SMA和Vimentin明显升高,而SQ2X组出现显著下调.在糖酵解水平的评价方面,虽然大鼠血清乳酸水平并未受到5/6肾切除手术和SQ的影响,但是血清的丙酮酸水平和肾组织乳酸、丙酮酸水平出现显著升高,而SQ2X组的肾组织匀浆的乳酸和血清丙酮酸水平出现显著改善,肾组织丙酮酸水平也出现下降的趋势.另外,蛋白印迹法的结果发现,SQ2X可以明显改善CKD大鼠的肾组织糖酵解关键蛋白HK2和成纤维细胞标志物ɑ-SMA、Vimentin和增殖细胞核抗原PCNA的表达. 细胞实验部分,CKK-8、免疫荧光联合蛋白印迹法检测发现,TGF-β1 (10ng/mL)可以成功诱导NRK-49F细胞增殖.SQ以600ng/mL、1200ng/mL和2400ng/mL的浓度干预NRK-49F细胞,发现SQ对TGF-β1诱导的NRK-49F细胞增殖的抑制作用存在浓度依赖关系.Seahorse XFe24 细胞能量代谢检测发现 SQ 的干预可以降低TGF-β1诱导的NRK-49F细胞的质子流出速率;乳酸和丙酮酸检测结果显示,SQ可以下调TGF-β1诱导的NRK-49F细胞乳酸、丙酮酸的分泌;同样地,蛋白印迹法显示SQ可以抑制TGF-β1诱导的HIF-1ɑ和糖酵解关键蛋白PKM2、HK2表达;对应地,RT-qPCR检测发现SQ可以抑制TGF-β1诱导的HIF-1ɑ、PKM2、ɑ-SMA、Vimentin mRNA 水平.siRNA 转染技术沉默 NRK-49F 细胞的 HIF-1ɑ表达,结果发现沉默HIF-1ɑ可显著抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞HIF-1ɑ、PCNA蛋白表达和糖酵解水平.但是,当HIF-1ɑ沉默后,SQ干预后并不能进一步抑制NRK-49F细胞糖酵解及活化,提示SQ对NRK-49F细胞活化增殖和糖酵解的抑制作用可能依赖于HIF-1ɑ基因. 结论: 1. 三芪口服液可以改善 5/6Nx 大鼠肾功能及肾小管间质纤维化. 2. 三芪口服液可以下调 5/6Nx 大鼠 HIF-1ɑ介导的糖酵解水平,抑制成纤维细胞活化. 3. 三芪口服液可以抑制 TGF-β1 诱导的 NRK-49F 细胞活化. 4. 三芪口服液抑制 TGF-β1 诱导的 NRK-49F 细胞的 HIF-1ɑ/糖酵解通路关键蛋白的表达. 5. 三芪口服液在 HIF-1ɑ沉默的 NRK-49F 细胞中不能进一步抑制细胞增殖和下调糖酵解.
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