摘要
研究背景 多年以来，卵巢癌（Ovarian cancer，OC)严重威胁妇女健康，是妇女生殖系统最为常见的恶性肿瘤类型之一，其发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌。由于发病初期没有明显症状，初期诊断较为困难，在确诊时 60%~70%的患者往往已经发展到晚期，甚至已经发生远端转移，治疗效果不佳。晚期OC患者死亡率高达80%，占据妇科恶性肿瘤首位。根据美国癌症协会最新统计，2022 年将会有约19880名妇女被新诊断为卵巢癌，大约有12810名患者将死于卵巢癌。目前，对卵巢癌的治疗仍没有理想的分子标志物，因此，积极寻找有效的诊断分子标志物和新的治疗靶标对于准确评估卵巢癌患者病情及预后具有重要的现实意义。 随着第二代测序技术的快速发展，人类基因组面貌的逐渐呈现，高通量测序也逐步广泛地应用于探索恶性肿瘤的候选基因上。人类基因组研究计划揭示了超过 90%核苷酸序列转录生成的 RNA，其绝大部分为非编码 RNA（Non-coding RNA，ncRNA），它们开始被认为是“垃圾噪声”，而近年来，大量的研究表明ncRNA 在细胞正常生长发育过程中起着关键的调节作用，这为研究者们探索复杂疾病的生物机制提供了新的思考模式。相较于短链非编码 RNA 如（tsRNA， piRNA，snoRNA等），长度大于200nt的非编码RNA（Long non-coding RNA， lncRNA ）在维持机体正常生理活动和调控肿瘤发生发展中的作用更为复杂和广泛，日益受到研究者们的重视。大量研究表明，lncRNA是基因调控网络中的关键调控因子，其可通过“信号（signal)”、“诱饵（decoy）”、“向导（guide）”、“支架（scaffold）”等方式，在剂量补偿效应、基因转录修饰、蛋白质翻译调控和细胞周期凋亡调控等众多生命活动中发挥重要作用，进而影响细胞生长发育的过程，其表达或功能的异常与多种复杂疾病的发生发展密切相关。此外，lncRNA在不同恶性肿瘤中的差异表达及显著的组织特异性，影响着肿瘤的发生、浸润、侵袭和转移等疾病进程，这些特征使得 lncRNA 具有作为肿瘤诊断、进展及预后评价标志的巨大潜力，但随着对 lncRNA 的研究不断深入，仍有大量新发现lncRNAs 在肿瘤中的作用及分子机制尚未明晰。 课题组前期基于基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database， GEO），利用生物信息学方法对多个卵巢癌芯片数据集的基因探针序列进行基因组重注释，通过单因素 Cox 回归分析筛选出与卵巢癌预后相关的候选 lncRNAs ZFHX2-AS1作为本课题的研究对象。本课题拟通过qRT-PCR检测ZFHX2-AS1在卵巢癌组织和癌旁正常组织中的表达情况，分析其表达水平与卵巢癌患者临床特征、生存预后的关联，应用慢病毒包装技术构建稳定过表达ZFHX2-AS1的卵巢癌模式细胞系探究该lncRNA对卵巢癌细胞生物学表型的影响，应用系列分子实验揭示ZFHX2-AS1影响卵巢癌发生发展过程中的潜在作用机制，为卵巢癌患者靶向治疗及预后评估提供理论依据。 目的： 研究长链非编码RNA ZFHX2-AS1在卵巢癌组织中的表达，分析其与临床进展和生存预后的相关性，探究该lncRNA在卵巢癌进展中的功能作用及分子机理，以期为卵巢癌的靶向治疗、预后评估提供分子标志物。 方法： 1. 利用qRT-PCR技术在已收集的80例卵巢癌组织和42例癌旁正常组织中检测ZFHX2-AS1的相对表达量，并分析其表达水平与卵巢癌患者临床特征、生存结局的关联。 2. 应用慢病毒包装技术构建过表达ZFHX2-AS1慢病毒表达载体及其空白对照载体，转染人卵巢癌细胞系A2780和HO-8910，之后用嘌呤霉素筛选稳定过表达ZFHX2-AS1的卵巢癌模式细胞系，qRT-PCR法检测其转染效率。 3. 通过细胞增殖、平板克隆形成、细胞周期、迁移侵袭等生物学功能实验验证ZFHX2-AS1对卵巢癌细胞生物学表型的影响。 4. 通过RNA荧光原位杂交、转录组测序、RNA pull-down、RNA免疫沉淀（RIP）、western blot等实验并结合生物信息学手段探索 ZFHX2-AS1 影响卵巢癌恶性进展的内在调控机制。 结果： 1. 相较于癌旁正常组织，ZFHX2-AS1在卵巢癌组织中的表达水平明显下调[中值(Q25, Q75)：0.00293(0.00106 ， 0.00702) vs. 0.00899(0.00459 ， 0.01639) ， Plt;0.0001]。ZFHX2-AS1在癌组织中表达下调的结果在TCGA/GTEx公共数据集中进一步得到了验证（Plt;0.01）。 2. ZFHX2-AS1的表达水平与卵巢癌患者的临床病理分期呈负相关关系（r=-0.344，Plt;0.01）。低表达ZFHX2-AS1卵巢癌患者的生存期较短（22.8 月vs. 48.2月， log-rank 检验 P=0.0054 ） ，预后结局不良[HR=2.94 ， 95%CI(Confidence Interval)=1.28-7.14，Plt;0.05] 。 3. CCK8细胞增殖实验结果显示，稳定过表达ZFHX2-AS1的A2780和HO-8910卵巢癌细胞株的细胞增长速率均显著低于其相应的空白对照组（Plt;0.05）。 4. 平板克隆形成试验显示，过表达ZFHX2-AS1卵巢癌细胞的克隆形成数均低于其相应的空白对照组细胞（A2780 细胞株：262.33±8.65 vs. 489.33±10.21， Plt;0.0001；HO-8910细胞株：137.67±11.84 vs. 269±14，Plt;0.001）。 5. 采用流式细胞术检测稳定过表达ZFHX2-AS1的卵巢癌细胞A2780和HO-8910及其空白对照细胞周期分布的情况，结果显示，相较于对照组细胞，过表达ZFHX2-AS1的卵巢癌细胞A2780和HO-8910能够增加DNA合成期（S期）的比例（ A2780: 28.73±0.82 vs. 26.79±0.95 ， P=0.0539；HO-8910: 28.43±0.94 vs. 26.48±0.80，P=0.0522），但差异没有统计显著性。 6. Transwell迁移和侵袭实验结果显示，相较于空白对照细胞，过表达ZFHX2-AS1的卵巢癌细胞A2780和HO-8910的迁移和侵袭能力显著降低（迁移实验：A2780：126.3±9.84 vs. 352.7 ±16.81，Plt;0.0001；HO-8910：93±3.27 vs. 188± 13.49，Plt;0.001；侵袭实验：A2780：45±5.35 vs. 122±9.90，Plt;0.001；HO-8910：31±5.10 vs. 94±5.35，Plt;0.001）。 7. 蛋白质编码功能预测网站CPAT和CPC均显示ZFHX2-AS1不具备蛋白质编码功能，FISH亚细胞定位结果显示ZFHX2-AS1主要定位在核内。 8. 对稳定过表达ZFHX2-AS1的卵巢癌细胞A2780和HO-8910及其空白对照组进行转录组测序，结果显示ZFHX2-AS1过表达后可影响多个下游潜在靶基因RNA的表达水平。应用生物信息学方法对两细胞系内共同差异表达基因进行GO功能注释和KEGG富集分析，结合文献报道筛选ZFHX2-AS1下游调控的潜在靶基因ARHGAP5，该基因广泛参与肿瘤转移相关的信号通路，是促进肿瘤进展的关键因子。采用 qRT-PCR 和 western bolt 实验检测证实，在两组过表达ZFHX2-AS1的卵巢癌细胞中，ARHGAP5的表达水平均显著下调。 9. RNA pull-down 联合质谱分析，并结合生物信息学分析预测，筛选与ZFHX2-AS1和ARHGAP5可能存在结合的结合蛋白DKC1，银染和western blot实验证实 ZFHX2-AS1 与 DKC1 之间存在结合作用。荧光共定位、qRT-PCR 及western blot实验分析ZFHX2-AS1对DKC1表达及细胞内分布的调控作用，结果表明，ZFHX2-AS1与DKC1主要在核内结合富集，但ZFHX2-AS1不影响DKC1的表达及空间定位。 10. 利用siRNA技术在卵巢癌细胞A2780和HO-8910内敲低DKC1表达水平，qRT-PCR 和 western blot 实验验证其转染效率并检测 DKC1 基因是否调控ZFHX2-AS1 和 ARHGAP5 的表达，结果发现敲低 DKC1 的表达后，不影响ZFHX2-AS1的表达，而ARHGAP5的表达则显著下调。 11. 采用RIP实验研究DKC1蛋白与ZFHX2-AS1和ARHGAP5在卵巢癌细胞A2780和HO-8910结合情况，结果表明，DKC1抗体在两种细胞内均能显著富集ZFHX2-AS1和ARHGAP5，提示三者之间存在调控关系。基于文献报道， DKC1编码的Dyskerin蛋白属于TruB家族的假尿苷合成酶，其主要负责催化产生tRNA的TΨC环上55 位的假尿苷修饰。我们通过生物信息学网站PPUS和PIANO预测ARHGAP5是否存在假尿苷合酶修饰位点，结果显示，在ARHGAP5基因序列上两个网站均预测到多个假尿苷合酶潜在的修饰位点，且存在多个位点在两个网站中同时被预测。提示DKC1能够在转录后调控ARHGAP5基因表达，这种调控作用可能是 ZFHX2-AS1 与 DKC1 的结合影响了其对下游基因ARHGAP5的假尿苷修饰。 结论： 1. ZFHX2-AS1在卵巢癌组织中呈现异常低表达， ZFHX2-AS1低表达与卵巢癌临床分期呈负相关，低表达ZFHX2-AS1的卵巢癌患者的生存期较短，预后结局不良。 2. ZFHX2-AS1发挥类抑癌基因功能，能够有效抑制卵巢癌细胞增殖、减少其克隆形成数量、降低其迁移侵袭能力。 3. ZFHX2-AS1通过结合DKC1蛋白在转录后影响下游基因ARHGAP5的表达进而影响卵巢癌的发生发展，可作为卵巢癌靶向治疗及预后评估的潜在生物标志物。
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