摘要
背景与目的 卒中后抑郁（Post-stroke depression，PSD）是脑卒中患者常见的神经精神并发症之一，既往研究显示约三分之一的卒中幸存者患有PSD ，缺血性脑卒中和出血性脑卒中患者均可能发生卒中后抑郁，其主要症状包括情绪低落、兴趣缺失、睡眠障碍等。PSD影响患者正常生活，延长患者恢复时间并且增加社会负担。PSD的致病机制主要包括单胺类递质假说、细胞炎症因子假说、脑源性神经营养因子假说、神经环路及功能损伤假说和心理社会因素假说等。目前PSD的治疗主要参照重度抑郁症（Major depressive disorder，MDD）的治疗方式，以选择性五羟色胺再摄取抑制剂和三环类抗抑郁药为主，但是仅一半临床患者从药物治疗中获益，并且平均需要四周才起效，提示依靠现有治疗靶点开发的治疗方法尚不能满足临床患者需求。因此，需要更加深入探索PSD的特征改变并寻找有效的治疗靶点。 代谢物紊乱是PSD研究的重点内容之一，谷氨酸、谷氨酰胺等氨基酸在PSD发病中起到了重要作用，五羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素等神经递质水平降低也是PSD的重要病理改变。研究显示各种代谢物在PSD小鼠的不同组织及脑区间呈不同变化趋势，因此在与PSD相关的关键脑区研究其代谢物、细胞和基因变化有助于解析PSD的核心病理改变。既往研究发现内侧前额叶皮层（Medial prefrontal cortex， mPFC）在抑郁症中具有重要作用，mPFC接受来自大脑皮层的传入信号，经过处理后传至其他皮层及皮层下区域，与纹状体、伏隔核、海马、杏仁核、腹侧被盖区等脑区形成的神经环路对抑郁焦虑等疾病具有重要的调控作用，因此本研究主要聚焦于mPFC及相关核团在PSD中的变化情况。 本研究结合神经递质靶向代谢组学和单细胞转录组测序等技术手段，解析PSD小鼠mPFC脑区的代谢物及基因变化，发现PSD小鼠mPFC和海马脑区的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量显著降低，并且GSH代谢是多种差异代谢物共同参与的代谢通路。因此本研究将GSH作为研究切入点，聚焦关键代谢物GSH及其影响，研究PSD的发病机制和特征改变，为将来寻找可靠的治疗靶点提供理论基础。 材料与方法 1. PSD小鼠模型的建立：对 8-10周雄性 C57BL/6J小鼠 mPFC注射内皮素-1 （Endothelin-1，ET-1）造成局部梗死，恢复2周后进行高架十字实验、旷场实验、悬尾实验和糖水偏好实验等行为学检测，通过行为学检测结果筛选具有抑郁样行为表现的PSD小鼠。 2. 神经递质靶向代谢组：检测PSD小鼠（PSD组）与假手术组小鼠（SHAM组） mPFC的代谢物变化，通过生物信息学分析筛选PSD组与SHAM组相比显著改变的神经递质和氨基酸等代谢物。 3. GSH/GSSG检测：通过还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（ Glutathione/Oxidized glutathione ， GSH/GSSG ）试剂盒检测PSD小鼠mPFC和与其有环路关联的杏仁核、海马、纹状体等核团GSH及GSSG含量变化。 4. 单细胞转录组测序：单细胞转录组测序检测PSD小鼠皮层和海马的变化情况，进行降维聚类、细胞注释以及功能富集分析等生物信息学分析探索与GSH代谢异常相关的细胞及基因改变。 5. 铁死亡相关指标检测：丙二醛（Malondialdehyde，MDA）试剂盒检测PSD小鼠 mPFC 及海马组织 MDA 变化情况，免疫荧光检测谷胱甘肽过氧化物酶 4 （ Glutathione peroxidase 4 ， GPX4 ）在 mPFC及海马的表达情况，实时荧光定量PCR检测Gpx4 mRNA含量变化。 6. 外源性补充谷胱甘肽：通过对PSD小鼠腹腔注射外源性补充 GSH后进行MDA检测及GPX4免疫荧光检测和实时荧光定量PCR检测，以及高架十字实验、旷场实验、悬尾实验等行为学实验，探索其是否能缓解PSD小鼠细胞铁死亡并且改善小鼠抑郁样行为表现。 结果 1. 小鼠局部梗死mPFC后在旷场中央区时间、高架十字开臂时间显著下降，糖水偏好比例显著下降，悬尾静止不动时间显著增加，提示该方法可以有效诱导小鼠卒中后抑郁样行为表现，可以作为稳定的PSD小鼠模型。 2. 在检测到的38种代谢物中，有 9种在PSD小鼠mPFC表现为显著性减少，其中下调最明显的是GSH ，并且对9种差异代谢物进行代谢通路富集分析发现主要富集在GSH代谢通路， GSH/GSSG检测发现在PSD小鼠mPFC和海马出现还原型GSH含量下降的现象。 3. 单细胞转录组测序发现PSD组和SHAM组小鼠皮层和海马主要有神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞和T细胞等9种细胞类型，ssGSEA富集分析发现GSH代谢主要发生在星形胶质细胞，PSD组和SHAM组小鼠星形胶质细胞进行差异分析筛选出270个差异基因（Differentially expressed genes，DEGs），对DEGs进行KEGG和GSEA功能富集分析发现DEGs在铁死亡、脂肪酸代谢等通路显著富集，DEGs与GSH代谢通路相关的72个基因取交集得到1个关键基因Gpx4。 4. PSD小鼠mPFC和海马的MDA含量显著增加，实时荧光定量PCR检测显示PSD小鼠mPFC和海马的Gpx4 mRNA含量显著下降，免疫荧光结果显示GPX4阳性星形胶质细胞、GPX4阳性神经元、GPX4阳性内皮细胞均有减少现象，并且星形胶质细胞减少幅度最大。 5. 腹腔注射外源性补充GSH的治疗组与补充等剂量生理盐水的对照组相比能够显著减少PSD小鼠mPFC和海马MDA含量并且增加GPX4阳性星形胶质细胞比例和Gpx4 mRNA含量，同时与对照组相比外源性补充GSH可以显著增加PSD小鼠旷场中央区时间和高架十字开臂时间，并且减少悬尾实验静止不动时间，提示外源性补充GSH使PSD小鼠细胞铁死亡及抑郁样行为得到改善。 结论 本研究利用神经递质靶向代谢组和单细胞转录组测序等测序方法，发现PSD小鼠关键脑区mPFC和海马中还原型GSH含量减少，而GSH代谢异常引发了相关脑区的细胞铁死亡，并且主要影响星形胶质细胞，通过腹腔注射的方式外源性补充GSH可以有效缓解mPFC和海马的细胞铁死亡，并且改善PSD小鼠的抑郁样行为。该研究探索了GSH及铁死亡在PSD的重要作用，为探索PSD的发病机制和病理特征提供了新的见解，并且为将来以此为靶点开发相关药物提供了理论基础。
NETL