摘要
研究背景： 随着肿瘤发病率的快速增长，越来越多的人处于带瘤生存状态，而这些带瘤生存生存的病人很多后期出现了心血管问题，并且死亡的原因并不少因为肿瘤，而是死于心血管疾病，其中主要的原因是化疗药物的心脏毒性[1]。阿霉素(Doxorubicin，DOX)是一种蒽环类抗生素，通常用于治疗一系列癌症，包括乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌和晚期食管鳞状细胞癌等，是最有效的抗癌药物之一[2-6]。然而，一些副作用限制了其治疗价值，主要包括心脏毒性，这可能导致心脏功能的不可逆损失，最后导致心力衰竭[7,8]。阿霉素的心脏毒性机制复杂，且缺乏特异性药物治疗，目前，经过FDA批准的唯一专门用于接受蒽环类化疗药物的患者心脏保护剂是右雷佐生。然而，需要注意的是，右雷佐生诱发的骨髓抑制、肝毒性和继发性恶性肿瘤发展等不良反应多发[9]。因此，急需更有效、更安全的心脏保护药物来治疗化疗相关的心脏毒性。 代谢功能紊乱是造成阿霉素心肌损伤的关键机制，造成细胞代谢重编程[10]。司美格鲁肽(Semaglutide，SEMA)属于GLP-1受体激动剂，为代谢信使，在调节血糖稳态和改善代谢中发挥着重要作用[11]，已被发现可改善急性心肌梗死和严重收缩功能障碍患者的左心收缩功能[12,13]。此外，它还改善了慢性心力衰竭患者的左心室射血分数和功能状态[14]。虽然司美格鲁肽受体激动剂的心脏保护作用已得到证实，但其对肿瘤化疗药物心脏毒性中的作用尚未得到很好的研究。综上所述，司美格鲁肽可能对阿霉素诱导的心脏毒性有保护作用。因此，本研究旨在深入探究司美格鲁肽在阿霉素引发的心脏毒性中的作用，并揭示其可能的作用机制。 研究方法： 1.司美格鲁肽改善阿霉素诱导的心功能紊乱。 使用C57BL/6J小鼠，并通过每周一次，连续4周的腹腔注射阿霉素来构建阿霉素心肌损伤模型。同时，我们给小鼠皮下注射司美格鲁肽(Semaglutide，SEMA)或等体积的生理盐水作为对照。我们通过心脏超声和血流动力学检测来评估心脏收缩功能，检测小鼠的体重、心脏和胫骨长度比，以及小鼠死亡率，并通过ELISA法检测了血清中的LDH、CK-MB和BNP水平。为了观察心肌组织结构，使用了HE染色法，并通过WGA染色来观察心肌细胞萎缩情况，Masson染色来检测心肌组织中的胶原沉积，此外，还采用了TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况。 2.司美格鲁肽缓解阿霉素损伤的心肌线粒体功能。 2.1为分析司美格鲁肽改善阿霉素诱导的心脏毒性的病理机制，除了动物模型还通过提取新生SD大鼠的原代心肌细胞建立了阿霉素心肌毒性的细胞模型。 2.2通过γ-H2AX免疫荧光染色评估阿霉素对心肌细胞DNA的损伤情况，通过活性氧(Reactive oxygen species ，ROS)染色检测了活性氧的生成，通过线粒体通透性转换孔(Permeability transition pore，PT-pore)检测来评估线粒体通透性转换孔的开放情况，采用线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)检测手段来评估线粒体的功能状态，通过线粒体电镜观察线粒体形态学改变，通过线粒体压力测试评估线粒体呼吸功能。 2.3通过转录组测序数据进行功能富集检测变化的生物学过程。 3.司美格鲁肽通过抑制BNIP3在线粒体上表达来改善线粒体功能。 3.1通过动物模型的转录组测序数据分析差异基因。 3.2通过qPCR验证差异基因和WesternBlot验证基因的蛋白表达情况。 3.3在细胞模型上通过免疫荧光共定位和细胞成分蛋白WesternBlot明确BNIP3在线粒体的表达情况。 3.4通过小鼠过表达BNIP3验证司美格鲁肽在过表达BNIP3情况下对阿霉素心脏 毒性的治疗效果，检测小鼠血清中的LDH、CK-MB水平，通过心脏超声和血流动力学检测来评估心脏收缩功能，为了观察心肌组织结构，我们使用了HE染色法，并通过WGA染色来观察心肌细胞萎缩情况，Masson染色法来检测心肌组织中的胶原沉积，此外，还通过线粒体电镜观察线粒体形态学改变。 4.司美格鲁肽通过PI3K/AKT/BNIP3通路改善线粒体稳态。 4.1通过动物模型的转录组测序数据进行通路富集。 4.2体外使用PI3K/AKT通路抑制剂(LY294002)，通过WesternBlot验证司美格鲁肽激活了PI3K/AKT通路，通过线粒体ROS染色验证司美格鲁肽通过PI3K/AKT通路调控了线粒体氧化应激，通过线粒体通透性转换孔检测、线粒体膜电位检测和线粒体压力测试验证司美格鲁肽通过PI3K/AKT通路调控线粒体稳态，通过BNIP3和线粒体免疫荧光共定位验证司美格鲁肽通过PI3K/AKT通路调控BNIP3在线粒体上的表达。 研究结果： 1.构建C57BL/6J小鼠阿霉素心肌损伤模型，发现司美格鲁肽缓解了左心室收缩功能，改善了心肌细胞损伤和心肌结构，降低了心肌纤维化，减少了心肌细胞死亡。 2.司美格鲁肽在体内外模型改善了阿霉素诱导的心肌细胞DNA损伤和ROS产生，改善线粒体通透性转换孔的开放情况和线粒体膜电位，增强了线粒体氧化呼吸能力。转录组测序验证了司美格鲁肽主要影响了阿霉素心脏毒性心肌细胞的线粒体功能相关基因。 3.通过转录组测序数据分析差异表达最明显的前十位差异基因，通过qPCR和WesternBlot验证发现BNIP3变化最明显，深入研究发现司美格鲁肽主要抑制BNIP3在线粒体上的表达，从而改善线粒体形态和线粒体功能，过表达BNIP3可以阻断司美格鲁肽对阿霉素心脏毒性造成的心肌损伤、心衰的改善作用。 4.进一步研究发现司美格鲁肽显著激活了PI3K/AKT通路，而PI3K/AKT通路抑制剂抵消了司美格鲁肽对线粒体功能的保护作用，荧光共定位显示PI3K/AKT通路抑制剂增加了司美格鲁肽和阿霉素联合处理组心肌细胞中的BNIP3在线粒体上的表达。 结论： 1.司美格鲁肽可以改善阿霉素诱导的心脏毒性。 2.司美格鲁肽主要改善阿霉素诱导的心脏毒性心肌细胞的线粒体功能。 3.司美格鲁肽通过抑制BNIP3在线粒体上的表达来改善线粒体稳态。 4.司美格鲁肽通过激活PI3K/AKT通路来抑制BNIP3在线粒体上的表达。
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