摘要
研究背景及目的：非酒精性脂肪肝（NAFLD）是目前临床上最常见的一类慢性肝病，且尚无有效的治疗药物。圣草酚（Eri）是广泛存在于蔬菜水果中的一类二氢黄酮类天然化合物，其具有抗炎、抗氧化等药理活性。然而，Eri对NAFLD的作用及机制尚待验证和进一步深入研究。本研究通过构建体内外NAFLD模型，探讨Eri对NAFLD的作用并初步探究其机制。 研究方法： 一、Eri缓解NAFLD的在体研究 1.Eri给药后对HFD诱导的NAFLD模型C57小鼠的影响 （1）采用高脂饮食（HFD）诱导雄性C57BL/6J小鼠体内NAFLD模型，HFD预处理造模4 周后，从第5 周开始腹腔注射50 mg/kg 和100 mg/kg Eri 连续处理6 周。在腹腔注射处理动物期间记录不同组小鼠体质量和摄食量。 （2）给药处理 6 周后，处死小鼠，收集组织样本和血清样本，称量肝脏质量并记录，拍摄小鼠肝组织照片。分离小鼠肝组织分别使用4%多聚甲醛固定或冻存。 （3）收集的小鼠肝组织样本分别进行HE染色和油红O染色观察NAFLD造模后和Eri给药后小鼠肝组织病理变化和肝组织内脂质沉积情况。 （4）测定小鼠血清样本中天冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷氨酸氨基转移酶（ALT）、胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-C）水平。 2.Eri给药后对db/db小鼠自发性NAFLD模型的影响 （1）db/db小鼠为瘦素受体缺乏的基因突变鼠，能够自发产生NAFLD，腹腔注射100mg/kg Eri，验证Eri 能否缓解db/db 小鼠自发性NAFLD，Eri 给药持续5 周。腹腔注射处理动物期间记录不同组别小鼠体质量和摄食量。 （2）给药处理 5 周后，处死小鼠，收集组织样本称量肝脏质量并记录，拍摄小鼠肝组织照片。分离小鼠肝组织分别使用4%多聚甲醛固定或冻存。 （3）收集的小鼠肝组织样本油红O染色观察NAFLD模型和Eri给药后小鼠肝组织内脂质沉积情况。 二、Eri缓解NAFLD的体外研究 1.Eri处理对OA诱导的体外NAFLD模型的影响 （1）采用油酸（OA）处理HepG2细胞诱导体外NAFLD模型，使用CCK-8分别对OA和Eri处理HepG2细胞的浓度进行筛选，明确体外造模和给药处理细胞的条件。 （2）通过尼罗红染色和油红O染色，对OA处理HepG2细胞构建体外NAFLD模型的效果以及Eri对OA处理后HepG2细胞中脂质沉积情况进行了研究。 （3）收集细胞样本，对细胞样本中丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、总胆固醇（TC）、TG和超氧化物歧化酶（SOD）的水平进行检测，对Eri缓解体外NAFLD模型的效果进行验证。 三、Eri缓解NAFLD的机制研究 1.蛋白质组学分析Eri缓解体内NAFLD的机制 （1）随机选取前述收集的正常组、模型组、Eri给药高剂量组小鼠肝组织样本，进行质谱分析。 （2）根据质谱分析结果，分析不同组小鼠肝组织样本中差异表达蛋白。 （3）根据质谱结果统计得到的差异表达蛋白进行 KEGG 通路分析，GO 功能分析等生物信息学分析，筛选Eri缓解NAFLD的关键分子和通路。 2.Eri抑制氧化应激和炎症缓解NAFLD （1）ELISA 分别测定不同组别小鼠肝组织和细胞样本中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素6（IL-6）水平。 （2）蛋白免疫印迹（WB）分别检测不同组别小鼠肝组织样本和细胞样本中核因子-E2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶1（HO-1）、核因子κB（NF-κB）表达水平。 （3）免疫组化检测不同组别小鼠肝组织中Nrf2和HO-1水平及分布情况。 2.Eri抑制UBA52促进自噬缓解NAFLD （1）WB分别检测不同组别小鼠肝组织样本和细胞样本中UBA52、p62和LC3表达水平。 （2）免疫组化检测不同组别小鼠肝组织中p62水平。 （3）透射电镜检测不同组别HepG2细胞中自噬小体的生成。 （4）在转入 LC3 荧光双标质粒的 HepG2 细胞中使用分别使用前述浓度诱导体外NAFLD模型并使用Eri处理细胞。激光共聚焦显微镜拍摄，观察不同组别细胞内荧光变化情况。 （5）在HepG2细胞中使用siRNA敲低UBA52后OA诱导体外NAFLD模型并使用Eri处理细胞，WB分别检测不同细胞样本中UBA52、p62和LC3表达水平进行回复验证。 实验结果： 一、Eri缓解NAFLD的在体研究 1.HFD 诱导后，小鼠体质量和肝脏质量显著增加，肝脏体积显著增大，提示体内NAFLD模型构建成功。 2.Eri给药6周后，小鼠体质量、摄食量、肝脏质量显著降低，肝脏体积显著减小，提示Eri给药有效缓解体内NAFLD。 3.油红O染色和HE染色结果显示，NAFLD小鼠肝组织生理结构遭到破坏且肝脏中出现大量脂质沉积；Eri给药后肝组织微观结构破坏得到缓解，且脂质沉积显著减少。 4.血生化指标检测结果显示，NAFLD小鼠ALT、AST水平显著增加，提示小鼠肝功能受到损害，TG、TC、LDL-C水平增加提示小鼠体内脂质水平增加；而Eri给药后ALT、AST、TG、TC和LDL-C水平均下降，提示Eri能缓解体内NAFLD对小鼠造成的的肝功能损害和脂质水平增加。 5.db/db小鼠给药后体质量、摄食量、肝脏质量显著降低，油红O染色结果显示Eri给药后肝脏中脂质沉积显著减少,说明Eri能够缓解db/db小鼠NAFLD。 二、Eri缓解NAFLD的体外研究 1. 通过CCK-8筛选，使用0.5 mM OA 处理HepG2细胞以诱导体外NAFLD模型，并分别使用50 和100 μM Eri 处理细胞以评估Eri 对体外NAFLD模型的缓解作用。 2. 尼罗红染色和油红 O 染色结果表明，使用 0.5 mM OA 处理 HepG2 细胞后胞内脂质沉积显著增加，体外NAFLD模型诱导成功。而Eri处理显著减少OA引起的胞内脂质沉积。 3. TC、TG、ROS、MDA和SOD 等生化指标检测结果表明，Eri 给药减轻体外NAFLD模型中的脂质沉积、肝细胞损伤和氧化应激。 三、Eri缓解NAFLD的机制研究 1.蛋白质组学结果表明Eri能够调控多种蛋白缓解体内NAFLD，且其缓解NAFLD可能与缓解氧化应激，激活自噬有关。同时，UBA52可能是影响NAFLD进展的关键分子。 2. WB、免疫组化和 ELISA 等方法检测分析结果表明，Eri 通过激活 Nrf2/HO-1 信号通路以缓解氧化应激和炎症。 3.WB、免疫组化、透射电镜和激光共聚焦等方法检测结果表明，Eri通过抑制UBA52促进自噬以缓解体内外NAFLD。 4.体外通过siRNA低表达UBA52后回复验证了抑制UBA52能够促进自噬，以及Eri能调控UBA52表达以促进自噬。 结论：Eri能缓解体内外NAFLD，其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路以缓解氧化应激和炎症，同时抑制UBA52这一影响NAFLD进展的关键分子的表达以促进自噬，从而发挥其缓解体内外NAFLD的作用。
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