摘要
研究背景： 流行病学研究发现，长期接触、暴露于环境致癌物与癌症发病率显著增加有关。化学致癌是多因素、多基因参与的多阶段过程。随着近年来研究的不断深入，表观遗传修饰在肿瘤研究机制中的重要作用越来越被重视和关注。IFI44L是课题组前期通过组学方法在化学致肺癌过程中筛选鉴定的新表观调控基因。研究报道IFI44L与自身免疫、抗病毒反应及肿瘤进展等密切相关。通过查阅文献并结合前期研究，我们推测IFI44L在肺癌发生发展过程中发挥重要作用，但具体作用机制有待深入研究。因此，本研究从体内体外等多方面进行实验设计，系统研究IFI44L在肺癌中的表观调控模式及作用机制，为从表观调控角度探索肺癌的早期标志物和预后靶点提供新的思路。 研究目的： 1．探究IFI44L基因在肺癌中的免疫意义及预后价值； 2．探讨IFI44L基因在肺癌患者肿瘤组织和正常组织中的表达情况及其临床病理资料、生存预后之间的关系； 3．揭示IFI44L基因调控肺癌细胞凋亡的作用机制； 4．探索IFI44L基因在调控肺癌免疫微环境中的作用机制。 研究方法： 1．从公共数据库中收集数据，通过生物信息学方法系统分析IFI44L在肺癌中的免疫意义。 2．基于公共数据库收集的肺癌患者数据，分析IFI44L基因在肺癌患者肿瘤组织和正常组织的表达情况、甲基化情况及其与临床病理特征和总生存期之间的关联，利用临床患者样本及Kaplan-Meier Plotter样本进行表达及预后分析验证。 3．采用RT-qPCR及Western blotting检测IFI44L基因在化学致癌物诱导的细胞恶性转化过程及不同肺癌细胞株中的表达情况，采用去甲基化药物处理分析甲基化对IFI44L表达的影响。 4．在不同肺癌细胞株中建立IFI44L基因差异表达模型，采用CCK-8实验、集落形成实验检测肺癌细胞的增殖与活力，通过流式细胞仪分析细胞凋亡；采用划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞的迁移、侵袭能力。 5．通过裸鼠皮下成瘤模型和尾静脉注射转移模型，分析IFI44L基因在体内对肺癌细胞增殖及转移的影响。 6．采用Co-IP、RIP、mRNA稳定性实验，明确IFI44L相互作用分子及上下游关系，探讨IFI44L基因发挥作用的主要机制。 7．采用ELISA、细胞共培养、流式分析，明确IFI44L在肺癌发生发展过程中对免疫微环境的影响。 研究结果： 1．IFI44L与肿瘤免疫微环境组分密切相关并参与多种癌症和免疫相关途径 （1）通过公共数据库分析发现，IFI44L表达水平与NSCLC中的多种免疫浸润细胞（M1巨噬细胞、CD4+T细胞等）呈显著正相关。 （2）IFI44L参与NSCLC样本中的多个免疫/癌症相关通路（JAK/STAT1、T细胞受体信号通路等）。 （3）IFI44L相关免疫调节分子模型与TCGA-NSCLC患者的预后显著相关。 2．IFI44L基因表达水平在肺癌发生发展过程中显著下调 （1）化学致癌物诱导细胞恶转模型中，与DMSO对照组相比，IFI44L的mRNA及蛋白表达水平随恶转程度增加而显著降低（P＜0.05）。 （2）通过公共数据库分析临床患者数据显示，肺癌患者肿瘤组织中IFI44L基因表达水平明显降低（P＜0.01）。 （3）BaP染毒肺癌细胞后，与对照组相比，BaP染毒组IFI44L的mRNA及蛋白表达水平显著下调（P＜0.01）。 3．IFI44L基因表达与临床肺癌患者的生存预后呈正相关 （1）临床肺癌患者样本单因素分析表明IFI44L表达水平与AJCC分期呈明显负相关（χ2=5.853，P=0.016），但与年龄、性别、肿瘤大小、T分期、N分期和M分期无统计学关联。 （2）临床肺癌患者样本及公共数据库肺癌患者样本的单因素、多因素Cox回归分析均显示，IFI44L基因表达水平是肺癌患者的预后因素（P＜0.05）。 （3）临床肺癌患者样本及公共数据库肺癌患者样本的生存分析显示，IFI44L基因表达水平与肺癌患者总体生存期呈显著正相关（P＜0.05）。 （4）临床肺癌患者生存分析发现，吸烟和总体生存期呈显著负相关（P＜0.05），表明吸烟为肺癌患者危险因素。Kaplan-Meier Plotter生存分析结果表明，IFI44L显著提升吸烟患者的总体生存期（P＜0.001），而对不吸烟患者无影响（P＞0.05）。 4．IFI44L调控细胞凋亡参与化学致肺癌过程 （1）过表达IFI44L基因显著抑制肺癌细胞增殖，促进细胞凋亡。反之，低表达IFI44L基因抑制细胞凋亡并促进细胞活力。 （2）过表达IFI44L基因后JAK/STAT1通路关键分子XAF1、OAS1-3的mRNA及蛋白水平显著升高，干扰IFI44L基因表达后该通路下游关键分子表达受到明显抑制（P＜0.05）。 （3）质谱分析、Co-IP实验结果显示，IFI44L与STAT1存在蛋白相互作用。过表达IFI44L后，可通过促进STAT1磷酸化，激活JAK/STAT1通路，导致细胞凋亡增加。 （4）过表达IFI44L后同时干预STAT1表达，能够部分逆转IFI44L对肺癌细胞凋亡的调控。 （5）裸鼠皮下成瘤实验中，与对照组相比，过表达IFI44L组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量显著降低（P＜0.05），其肿瘤细胞增殖受到明显抑制，凋亡增加， JAK/STAT1通路下游关键分子表达显著升高。 5．IFI44L调控免疫微环境介导肺癌发生发展过程 （1）BaP恶转模型及BaP细胞染毒模型中，乳酸含量显著增加，乳酸化修饰水平明显增高，YTHDF2表达水平显著增加（P＜0.05）。RIP实验结果表明，YTHDF2与IFI44L的mRNA存在相互作用，RNA稳定性实验显示YTHDF2降解IFI44L的mRNA水平，提示乳酸化驱动YTHDF2调控mRNA降解可能是IFI44L在化学致肺癌过程中表达下调的原因。 （2）生信分析结果显示IFI44L表达与免疫微环境密切相关，尤其是M1巨噬细胞。细胞共培养、流式分析及ELISA等实验发现，干扰IFI44L基因表达显著抑制M1巨噬细胞极化，且M1巨噬细胞相关标志物表达明显下调（P＜0.05）；过表达IFI44L共培养组的肺癌细胞迁移侵袭能力显著降低（P＜0.001）。 （3）质谱分析及Co-IP实验发现，IFI44L与hnRNPA2B1存在蛋白相互作用，共表达IFI44L与hnRNPA2B1，发现hnRNPA2B1能够部分逆转IFI44L调控免疫微环境的作用。 （4）尾静脉注射裸鼠肿瘤转移模型结果显示，IFI44L过表达组生存期显著高于对照组及BaP染毒组，揭示IFI44L基因在体内对BaP致肺癌进展过程具有显著的抑制作用。 研究结论： 1．IFI44L在肺癌发生发展过程中表达下调。 2．IFI44L与多种免疫细胞及免疫途径关联，与肺癌患者预后呈显著正相关，是肺癌患者的预后因素。 3．IFI44L通过调控JAK/STAT1通路介导肺癌细胞凋亡过程。 4．IFI44L/hnRNPA2B1信号轴通过调控免疫微环境介导化学致肺癌过程。
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