摘要
编程性核糖体移码（programmed ribosomal frameshifting, PRF）是一种重编码现象，翻译中的核糖体能够在mRNA的特定位置，从起始的0读框转换到+1或者-1读框，然后继续翻译。影响编程性核糖体移码的因素主要分为两类，一类是顺式作用元件，主要包括七核苷酸滑动序列（slippery sequence）与刺激结构（stimulatory structure）；另一类是反式作用因子，主要包括抗生素、蛋白等。淡水纤毛类原生动物游仆虫（Euplotes）是单细胞真核生物，游仆虫中存在高频率的 PRF 现象，且移码基因的移码类型多样，但目前关于游仆虫编程性核糖体移码的调控机制并不清楚。本研究从顺式作用元件和反式作用因子两方面对八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）编程性核糖体移码的分子机制进行了系统分析。针对顺式作用元件，主要探讨了滑动序列对移码类型的影响；而在反式作用因子方面，主要探讨了真核翻译起始因子5A（Eukaryotic Translation Initiation Factors 5A, eIF5A）对编程性核糖体移码的影响。此外，还在酿酒酵母中研究了eIF5A对编程性核糖体移码的影响，探讨eIF5A对+1 PRF的调控作用在真核生物中是否具有普遍性。所得主要结果如下： 1.八肋游仆虫η-tubulin基因在翻译过程中需发生+1 PRF 利用生物信息学方法，从八肋游仆虫基因组数据库中鉴定得到20个微管蛋白基因，系统进化树分析发现这20个微管蛋白基因可分别归于α、β、γ、δ、ε和η六个亚家族，其中η-tubulin基因没有同源旁系基因；八肋游仆虫η-tubulin与其他生物的同源基因进行多序列比对发现八肋游仆虫 η-tubulin 基因在翻译过程中需发生+1 PRF，推测其滑动序列为AAATAAT。为了检测该基因在细胞内是否有蛋白产物，选择移码位点之后的多肽 257-270 作为抗原表位制备了多克隆抗体， Western blot检测到了特异性条带，表明八肋游仆虫η-tubulin为+1 PRF基因。 2.滑动序列是决定游仆虫移码类型的主要因素，移码类型与滑动序列中第一个密码子编码何种氨基酸无关 将 η-tubulin 基因克隆至游仆虫绿色荧光蛋白大核人工染色体重组质粒pBTub-Tel上，得到pBTub-Tel-η-tubulin，将η-tubulin的滑动序列AAA TAA T（+1 PRF）突变为TTA TAA T（+2 PRF），得到突变体mss1，随后在mss1的滑动序列TTA TAA后增加了一个A，得到mss2突变体（TTA TAA AT），使得mss1与mss2下游GFP报告基因分别位于+1和+2读框。分别将WT、mss1及mss2转染至八肋游仆虫细胞内。反转录PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）结果表明，转入的外源基因均具有转录活性。荧光显微镜观察三组细胞中 GFP 的表达情况，并测定相对荧光强度，结果表明滑动序列的改变使游仆虫η-tubulin基因的移码类型发生了改变。随后将 pBTub-Tel 中 GFP 的 78 位 ACAAAG 突变为ACATAAAG，675位GTGACC突变为GTGTAACC，得到两种突变体，将WT及两种突变体分别转染至八肋游仆虫细胞内。绿色荧光检测结果表明，滑动序列位置的改变对GFP基因的移码没有影响，结果表明滑动序列是决定游仆虫移码类型的主要因素。 将η-tubulin滑动序列的第一个密码子AAA分别突变为ATA和ATT（均编码异亮氨酸），得到mss3（ATATAAT）、mss4（ATATAAAT）、mss5（ATTTAAT）及mss6（ATTTAAAT）四种突变体，将WT及四种突变体分别转染至八肋游仆虫细胞内。RT-PCR结果表明转入的外源基因均具有转录活性，荧光显微镜观察五组细胞中 GFP 的表达情况，并测定相对荧光强度，结果表明移码类型与滑动序列中第一个密码子编码何种氨基酸无关，而与核苷酸基序有关。 3.八肋游仆虫RNA干扰（RNA interference, RNAi）实验体系的建立 通过对八肋游仆虫大核基因组数据库进行 BLAST 搜索，共鉴定得到 6 个Argonaute基因，10个Dicer基因和5个RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerases, RdRP）基因；与其他真核生物及原生动物的Argonaute同源序列进行系统进化树分析，结果表明所有八肋游仆虫Argonaute同源序列均保守地聚集在PIWI亚家族中，故分别命名为Eo-PIWI01、Eo-PIWI02、Eo-PIWI03、Eo-PIWI04、Eo-PIWI05和Eo-PIWI06；其中Eo-PIWI03、Eo-PIWI04和Eo-PIWI06都含有保守“DDH”基序，表明RNAi在八肋游仆虫细胞内是可行的。 选取八肋游仆虫 α 微管蛋白和 β 微管蛋白基因作为目的基因，将其分别克隆至L4440载体上，转化到RNase Ⅲ缺陷型菌株E. coli HT115中，诱导表达α-tubulin和β-tubulin dsRNA后喂食八肋游仆虫，qPCR结果显示α-tubulin基因的mRNA表达下降了约50%，β-tubulin基因的mRNA表达下降了约68%。表明八肋游仆虫细胞内RNAi体系建立成功。 4.八肋游仆虫eIF5A对+1位编程性核糖体移码具有促进作用 八肋游仆虫中有两种 eIF5A 基因，分别为 Eo-eIF5A1 和 Eo-eIF5A2。利用RNAi技术对Eo-eIF5A1进行基因沉默，qPCR结果显示eIF5A1转录水平下调了约56%，然而eIF5A2表达水平上调了2倍，进一步对Eo-eIF5A1和Eo-eIF5A2进行基因沉默，qPCR及Western blot结果表明Eo-eIF5As表达水平显著下调，同时干扰Eo-eIF5As后Eo-η-tubulin的蛋白表达下降了约50%。利用GC7处理八肋游仆虫抑制 Eo-eIF5As 的羟腐胺赖氨酸化修饰，Eo-η-tubulin 的蛋白表达也显著下调。利用兔网织红细胞体外转录翻译偶联系统体外验证羟腐胺赖氨酸化修饰的Eo-eIF5As对+1 PRF的影响，结果表明羟腐胺赖氨酸化修饰的Eo-eIF5As对游仆虫典型的滑动序列“AAA UAA A”处的+1 PRF具有促进作用。 5.酵母eIF5A对+1位编程性核糖体移码具有促进作用 酵母eIF5A的缺失可抑制Ty1基因+1 PRF的移码效率，但并不抑制L-A基因-1 PRF的移码效率，将野生型酵母eIF5A回补至eIF5A温度敏感型突变菌株， Western blot结果显示eIF5A温度敏感型突变菌株均表达了野生型酵母eIF5A蛋白，说明回补成功，双荧光素酶酶活检测结果显示Ty1基因+1 PRF的移码效率恢复正常水平；利用GC7抑制野生型酵母菌株eIF5A的羟腐胺赖氨酸化修饰或将其修饰位点赖氨酸突变为精氨酸，Western blot结果显示eIF5A的羟腐胺赖氨酸化修饰均明显受到抑制，双荧光素酶酶活检测结果显示Ty1基因+1 PRF的移码效率也均明显受到抑制；进一步对其调控机制进行研究，将靠近Ty1移码元件的0读框终止密码子突变为有义密码子转化至突变菌株及野生型酿酒酵母菌株，双荧光素酶酶活检测结果显示酵母eIF5A的缺失并不会抑制Ty1基因+1 PRF的移码效率，说明Ty1基因的+1 PRF移码效率对酵母eIF5A的依赖性消除，这种依赖性可能是由于0读框终止密码子相对Ty1滑动序列处于一个独特位置。利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）对野生型酵母、eIF5A 温度敏感型突变菌株及回补菌株的多胺含量进行测定，结果发现酵母eIF5A的缺失可下调腐胺与亚精胺的比例，将野生型酵母eIF5A回补至eIF5A温度敏感型突变菌株，腐胺与亚精胺的比例恢复正常水平，暗示酵母eIF5A可能通过调控腐胺与亚精胺的比例进一步调控Ty1基因+1 PRF的移码效率。 综上所述，本研究针对顺式作用元件，分析了滑动序列对移码类型的影响；在反式作用因子方面，探讨了真核 eIF5A 对编程性核糖体移码的影响。结果表明，游仆虫中滑动序列对移码类型起关键作用，且移码类型与滑动序列中第一个密码子编码何种氨基酸无关；羟腐胺赖氨酸化修饰的游仆虫eIF5As对+1位编程性核糖体移码具有促进作用；同样羟腐胺赖氨酸化修饰的酵母eIF5A对+1位编程性核糖体移码也具有促进作用。本研究为比较不同生物中编程性核糖体移码调控元件的特点奠定基础，为深入理解真核生物编程性核糖体移码调控机制提供了新的数据。
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