摘要
桃蚜是世界性重要害虫之一，目前主要利用化学方法防治蚜虫，但是化学农药的长期使用致使桃蚜抗药性骤升以及造成环境污染。因此，研发高效低毒对环境友好的生物杀虫剂已势在必行。绿僵菌由于其不易产生抗药性且具有高效杀虫活性，现已成为当前害虫生物防治中的研究热点，但其杀虫速度缓慢，生物控制的效率低下，很难应用于农业生产实践，有研究表明昆虫先天免疫系统的防御是影响绿僵菌防效的重要因素之一，但是害虫对绿僵菌的免疫机制尚不完全明确，而且在桃蚜中也缺乏系统研究，所以深入研究桃蚜抗真菌免疫反应机理对提高绿僵菌的生物防效具有重要意义。本文以桃蚜为研究对象，测定绿僵菌入侵前后桃蚜的转录组数据库，成功筛选出强烈响应绿僵菌的目的基因 Serpin-B6，分析 Serpin-B6 的分子生物学特性及表达模式；通过表达Serpin-B6重组蛋白和利用基因干扰技术研究Serpin-B6在桃蚜先天免疫反应中的功能；基于转基因技术构建表达dsSerpin-B6的绿僵菌并检测其毒力。研究结果如下： 1. 利用转录组测序分析比较绿僵菌处理桃蚜 3d 后的差异表达基因，结果表明：绿僵菌处理3d后，共有3184个基因在对照和绿僵菌处理组之间差异表达，其中上调基因2123个，下调基因1061个；筛选出受绿僵菌诱导表达的桃蚜免疫相关基因Serpin-B6，绿僵菌入侵后，其表达水平上调12倍。 2. 对响应绿僵菌的桃蚜 Serpin-B6 基因进行克隆，获得其 cDNA 全长，共有1146bp，编码382个氨基酸，分析发现其含有一个高度保守的SERPIN结构域。通过系统发育进化分析发现，桃蚜Serpin-B6基因与豌豆蚜Serpin-B4亲缘关系最近，其次是棉蚜Serpin-B6与花生蚜Serpin-B4等。运用实时荧光定量PCR方法检测了Serpin-B6在桃蚜不同龄期和身体部位的表达量，结果显示Serpin-B6在一龄中表达量最高，在身体部位特异性表达分析中，腹部表达水平最高。 3. 为了研究 Serpin-B6 在桃蚜先天免疫反应中的功能，通过原核表达的方式表达并纯化出桃蚜Serpin-B6重组蛋白，研究发现桃蚜rSerpin-B6自身既有抗真菌作用，又有对绿僵菌孢子的凝集作用；利用饲喂法对桃蚜Serpin-B6进行RNA干扰，在饲喂装置取食dsRNA 24h 后，桃蚜体内 Serpin-B6 基因被显著沉默，沉默效率为 65%，桃蚜Serpin-B6被干扰后，桃蚜免疫关键基因PO2及Toll表达水平显著下调，同时酚氧化酶活性降低。沉默桃蚜 Serpin-B6 基因后，绿僵菌对桃蚜的杀虫效果显著增强，由此结果可以推断出桃蚜Serpin-B6除了本身具有抗绿僵菌活性外，还正调控桃蚜黑化免疫反应。 4. 为了进一步提升绿僵菌的防治效果，本文构建了可以在绿僵菌体内表达dsSerpin-B6的载体，使其成功表达dsSerpin-B6，获得了基因重组绿僵菌，该菌株侵染桃蚜后，可以显著沉默桃蚜Serpin-B6基因，并表现出比野生菌株更高的杀虫活性。 本研究揭示了桃蚜免疫绿僵菌的关键基因Serpin-B6，并揭示了其在抗真菌免疫中的功能，获得了基于Serpin-B6-RNAi的高毒力的基因重组绿僵菌，研究结果对提高生防效率以及促进虫生真菌的广泛应用提供理论依据。
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