摘要
选题依据：柴归颗粒是对经典中药方剂“逍遥散”的抗抑郁药效及药效物质基础研究后，进行复方化裁后的得到抗抑郁中药新药，现已获得临床批件。课题组前期已明确柴归颗粒抗抑郁药效、建立了体外化学成分库，研究了柴归颗粒在大鼠体内的吸收、组织分布、代谢和排泄过程的特征规律，以及辅料对柴归颗粒药代动力学的影响，初步阐明了柴归颗粒的药效物质基础。前期的研究提示，口服柴归颗粒后，其包含的芍药苷、香草酸、芍药内酯苷、对羟基苯甲酸、柴胡皂苷 c、d、甘草次酸等成分可以入脑，另外有研究发现芍药苷、芍药内酯苷、柴胡皂苷d和甘草次酸可以直接作用于脑组织，对脑损伤具有保护作用，但目前对柴归颗粒中化学成分向脑组织分布转运的情况及其机制尚未研究。 近年来，对中药的活性成分、药效物质基础及其作用机制的研究十分关注。那么，基于前期研究，连续给药柴归颗粒后哪些化学成分可以吸收后进入脑组织并在脑组织中累积呢？柴归颗粒化学成分的吸收以及通过血脑屏障进入脑组织的机制是怎么样的，是否受转运体影响？柴归颗粒是否通过影响血脑屏障的通透性进而影响其化学成分在脑组织中的累积呢？由此，本研究拟在柴归颗粒化学成分可以入脑的基础上，研究单次与多次给药后柴归颗粒化学成分入脑的差异；转运体抑制剂对柴归颗粒化学成分药代动力学过程及其通过血脑屏障进入脑组织的影响；柴归颗粒对血脑屏障通透性的影响，并预测可能产生影响的成分，以期揭示柴归颗粒化学成分吸收和通过血脑屏障的机制，以及对血脑屏障的调控作用。 目的：明确单次与多次给药柴归颗粒化学成分入脑情况的差异，考察不同转运体抑制剂对柴归颗粒化学成分药代动力学和入脑的影响，评价柴归颗粒对血脑屏障通透性的影响，为柴归颗粒在脑组织中发挥抗抑郁药效的作用机制，以及其药效物质基础的确定提供有力的依据。 方法：1. 柴归颗粒单次与多次给药后入脑成分的对比研究：采集灌胃给药后各个时间点的大鼠脑组织及血液样本，经过甲醇沉蛋白等前处理后，应用UPLC-Q-TOF技术，采用 HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）以 0.1%甲酸水（A）和 0.1%甲酸乙腈（B）进行梯度洗脱，对柴归颗粒化学成分进行相对定量后，分析柴归颗粒化学成分在单次与多次给药后入脑的变化，并以变化的趋势为依据进行分类，为下一步探讨机制打下基础。 2．P-糖蛋白（P-gp）与乳腺癌耐药蛋白（BCRP）抑制剂对大鼠体内柴归颗粒化学成分药代动力学的影响研究：采用尾静脉注射方式给予BCRP抑制剂泮托拉唑（40 mg/kg，1 mL/200g）；采用腹腔注射方式给予 P-gp 抑制剂维拉帕米（30 mg/kg，1 mL/200g）。并于 30 min 后，灌胃给药柴归颗粒之后，采集各组多时间点的大鼠血清样本，经甲醇沉淀蛋白等前处理后，运用UPLC-Q-TOF分析方法，对血清中柴归颗粒化学成分进行相对定量后，运用DAS2.0软件对其进行药代动力学分析，并比较不同抑制剂对柴归颗粒中化学成分药代动力学特征参数的变化。 3．P-gp和BCRP抑制剂对柴归颗粒化学成分跨血脑屏障转运的影响研究：采用与前一章相同的抑制剂给药方式和给药剂量，采集灌胃给药后不同时间点大鼠脑组织样本及血液样本，经匀浆沉蛋白前处理后，应用液质联用技术，检测脑组织中柴归颗粒的化学成分并进行相对定量，考察不同抑制剂对柴归颗粒化学成分入脑的影响。 4．柴归颗粒对血脑屏障通透性的调控初探：依次采集给药1d、7d、14d的大鼠脑组织样本，通过qRT-PCR技术，考察连续给药对血脑屏障通透性的影响，并通过分子对接技术，预测柴归颗粒中可能发挥调控作用的成分。 结果：1．柴归颗粒单次与多次给药后入脑成分的对比研究：运用UPLC-Q-TOF分析方法，在灌胃柴归颗粒的大鼠脑组织中检测出27种成分。柴胡皂苷B2、柴胡皂苷c、芍药内酯苷、反式桂皮酸和没食子酸乙酯的脑血比较大，连续给药14天后它们在脑组织仍在不断累积，推测它们可能是柴归颗粒在脑部发挥药效的药效物质基础。与单次给药相比，多次给药柴归颗粒化学成分在脑组织中的变化趋势不同，以脑血比的变化趋势作为分类依据，将27种成分分成了两类，以待下一步探究发生变化的原因。 2．P-gp与BCRP抑制剂对大鼠体内柴归颗粒化学成分药代动力学的影响研究：基于 UPLC-Q-TOF 分析方法研究不同抑制剂对柴归颗粒入血的 32 种化学成分的药代动力学的影响，并得出相关药代动力学参数，将入血但无法入脑的5种成分（氧化芍药苷、绿原酸、原儿茶酸、甘草苷和芒柄花苷）归为第三类成分。与对照组相比，吸收入血的32种化合物中，有25种成分在泮托拉唑作用下吸收参数AUC增加，有18种在维拉帕米作用下AUC增加，推测BCRP和P-gp广泛参与柴归颗粒化学成分的吸收转运过程。依据吸收参数AUC/Cmax的显著变化的情况，推测第一类成分中芍药苷可能是P-gp底物；第二类成分中芹糖甘草苷推测是BCRP和P-gp的共同底物，甘草异黄酮醇、苯甲酸芍药苷、阿魏酸和异甘草苷可能为 BCRP 底物，芍药内酯苷可能为P-gp的底物；第三类成分中甘草苷推测是P-gp和BCRP的共同底物。 3．P-gp和BCRP抑制剂对柴归颗粒化学成分跨血脑屏障转运的影响研究：通过研究发现在抑制剂的作用下，部分成分脑血比发生了显著增加，同时结合药代动力学的研究结果，可以得出没食子酸乙酯、阿魏酸和芹糖甘草苷是P-gp和BCRP的共同底物；芍药苷、芍药内酯苷和香草酸是P-gp的底物；反式桂皮酸、苯甲酰芍药苷和甘草异黄酮醇是BCRP的底物。 4．柴归颗粒对血脑屏障通透性的调控初探：随着给药天数的增加，P-gp（MDR1）和Claudin-5的mRNA水平逐步上升，而BCRP、ZO-1、Occludin和JAM（F11）的mRNA水平，给药7天时上调，给药14天时出现下调现象。其中，连续给药显著上调了Claudin-5，显著下调了JAM-1的mRNA表达水平，这可能与柴归颗粒化学成分治疗抑郁症的机制密切相关。综合柴归颗粒化学成分与血脑屏障进行分子对接得到的最低结合能，推测乌拉尔甘草皂苷B、甘草酸和柴胡皂苷c可能对血脑屏障具有调控作用。此外，在前文确定为P-gp和BCRP的底物的成分中，发现P-gp抑制剂维拉帕米与芹糖甘草苷和阿魏酸，BCRP抑制剂泮托拉唑与异黄酮甘草醇、苯甲酰芍药苷、反式桂皮酸，它们之间可能存在竞争性抑制现象，维拉帕米和泮托拉唑分别结合到外排转运体P-gp和BCRP活性位点，因此使得芹糖甘草苷、阿魏酸、异黄酮甘草醇、苯甲酰芍药苷和反式桂皮酸外排减少，吸收增加。 结论：本文运用UPLC-Q-TOF的分析方法，明确了柴归颗粒可入脑的成分，并运用药代动力学和脑分布研究方法，明确了柴归颗粒中 P-gp 和 BCRP 的底物成分。另一方面，通过qRT-PCR和分子对接技术，初步探究了柴归颗粒对血脑屏障的调控作用及可能发挥调控作用的成分。结果表明P-gp和BCRP在柴归颗粒化学成分的吸收和入脑过程中发挥重要作用，并且发现柴归颗粒对血脑屏障相关蛋白具有调控作用，这为揭示柴归颗粒药效物质基础以及探明其吸收转运机制提供了有力的依据。下一步可通过细胞试验、分子互作等实验，进行深入研究。
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