摘要
目 的：通过对关白附生品和不同炮制品的化学成分、治疗中风的药效和机制进行比较研究，初步阐明关白附的炮制机理，为关白附的合理应用提供依据。 材料与方法： 1.采用高效液相色谱法（HPLC）测定关白附炮制前后次乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、关附甲素的含量，比较关白附炮制前后这些成分的含量差异。 2.将沙鼠适应性喂养一周后，随机分成空白组(CG)、模型组(MG)、阳性药组(PG)、关白附组(RA)、蒸制关白附组(SA)、姜矾制关白附组(GA)，除CG组外，其余各组均采用右侧单侧结扎沙鼠颈动脉造成中风模型。除MG组外，CG组灌胃生理盐水，其余4组分别灌胃阳性药脑络通颗粒混悬液和关白附、蒸制关白附、姜矾制关白附混悬液。观察各组沙鼠造模后和给药期间的行为学情况，对脑组织进行氯化三苯基四氮唑（TTC）染色测定脑梗死面积，并采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组沙鼠生化指标白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮（NO）的含量，比较各组之间指标的含量差异。 3.采用蛋白免疫印迹（Western blot）法测定沙鼠脑组织中PI3K 、P-Akt、KEAP1、HO-1各蛋白表达情况，并用免疫荧光测定沙鼠海马CA1区神经元细胞形态及蛋白表达。 4.采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法（UHPLC-Q-Orbitrap-MS）分析空白组、模型组、阳性药组、关白附组、蒸关白附组和姜矾制关白附组沙鼠尿液样品；采用多元统计方法对数据进行处理，筛选差异代谢物；采用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库结合MetaboAnalyst 5.0软件对筛选出的差异代谢物进行代谢通路分析。 结 果： 1.不同产地及批次的关白附生品及炮制品中均含有次乌头碱、苯甲酰次乌头原碱和关附甲素。次乌头碱及关附甲素炮制后含量显著降低，苯甲酰次乌头原碱炮制后显著升高。不同产地及批次的关白附中化学成分含量差异较大，但炮制后化学成分含量变化规律基本一致。 2.造模后各组沙鼠均表现为不同程度的神经功能缺损。与MG组相比，给药7天后关白附生品和各炮制品组的行为学评分具有显著差异；组内不同给药天数相比较，GA组给药第14天与给药第7天相比具有显著性差异。TTC染色结果表明，MG组沙鼠脑内缺血严重， RA、SA、GA组脑内供血均有恢复。6种生化指标在沙鼠脑组织和血清中的表达趋势相同。与CG组相比，MG组MDA、IL-6和TNF-α的水平显著增加（Plt;0.05）；与MG组相比，RA、SA和GA组这三个指标水平均显著下降（Plt;0.05）。与CG组相比，MG组的SOD、NO和GSH水平显著降低（Plt;0.05）；与MG组相比，RA、SA和GA组的这三个指标水平均显著升高（Plt;0.05）。 3.与CG组相比，MG组沙鼠脑组织中P-Akt、PI3K、HO-1、KEAP1的蛋白水平显著降低；与MG组相比，关白附生品和炮制品各组均能升高中风沙鼠脑组织中P-Akt、PI3K、HO-1、KEAP1的蛋白水平；免疫荧光染色结果显示，中风后沙鼠海马CA1区神经元细胞受损，关白附及其炮制品给药后能促进神经元细胞恢复，且上述蛋白能恢复表达。说明关白附在炮制前后均能有效促进PI3K/Akt和KEAP1/NRF2信号通路，且对PI3K/Akt和KEAP1/NRF2信号通路的作用程度大致相同。 4. L-Proline （ L-脯氨酸）、Riboflavin （核黄素）、Leukotriene D4 （白三烯D4 ）、7-Methylxanthine（7-甲基黄嘌呤）等112种差异代谢物可作为缺血性中风潜在生物标志物，涉及核黄素代谢、嘧啶代谢、嘌呤代谢等14条代谢通路。关白附生品回调了其中的核黄素代谢、嘧啶代谢等4条代谢通路；蒸关白附回调了其中的核黄素代谢、嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等5条代谢通路；姜矾制关白附回调了其中的咖啡因代谢和乙醛和二羧酸代谢2条代谢通路。 结 论： 1. 明确了炮制对关白附中三种生物碱类成分含量的影响。 2. 明确了关白附炮制前后均对缺血性中风有治疗作用，生品与炮制品作用效果相当，说明关白附炮制之后依然保留药效。 3. 明确了关白附炮制前后均能促进 PI3K/Akt 和 KEAP1/NRF2 信号通路，由此可推测PI3K/Akt和KEAP1/NRF2信号通路可能是治疗缺血性中风的作用机制之一。 4. 明确了缺血性中风疾病的内源性差异代谢物以及生品和炮制品对缺血性中风潜在生物标志物调节作用的异同；筛选出了与疾病相关的代谢通路，经关白附生品及其炮制品干预后主要影响氨基酸代谢和能量代谢。
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