摘要
大肠杆菌遗传背景清晰，遗传操作技术成熟，是表达重组蛋白的理想菌株。其中， BL21(DE3)菌株是具备出色性能的外源基因表达宿主菌。利用高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术对BL21(DE3)菌株进行精确的遗传改造，构建更为优良的工程菌株，从而实现目的蛋白的高效稳定表达，对于蛋白领域的研究和工业生产具有重要的价值。本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BL21(DE3)菌株进行了基因敲除、插入、替换等操作，构建出 lexA 基因缺陷的工程菌BL21(DE3)ΔlexA和高严谨性调控的工程菌株BL21(DE3)LacIq TT-pT5-RNAP。通过利用不同类型的表达载体对以上工程菌株进行功能验证，主要研究结果和结论如下： （1）将诱导型重组蛋白表达载体pET28a-nucB-lexA成功转化至工程菌株BL21(DE3)ΔlexA中，显著提升了该质粒的稳定性，约96%的细胞在长时间培养后依然没有丢失质粒。与传统方法不同的是，在利用BL21(DE3)ΔlexA菌株进行蛋白表达时，无需添加抗生素来维持质粒的稳定性。这一工程菌株的构建不仅为发酵过程中目的蛋白的持续稳定表达提供了有力保障，同时也避免了抗生素残留对环境造成的潜在风险。 （ 2 ）将诱导型蛋白重组表达载体 pET41a-iolI 成功转化至工程菌株BL21(DE3) LacIq TT-Pt5-RNAP中，以验证其高严谨性调控表达系统的性能。实验结果表明，在未加IPTG诱导的条件下，几乎不存在目的蛋白泄漏表达问题。有了这一优点，在表达毒性蛋白时，菌株在诱导表达之前能够维持一个相对稳定的生长状态，为蛋白质的高效表达提供了有力保障。这一实验结果验证了高严谨性调控表达系统在工程菌株中的可行性，也为后续利用该系统进行复杂、有毒性蛋白的表达研究奠定了坚实基础。 （3）将组成型重组蛋白表达载体pHCEⅡB-DGAS-lexA成功转化至工程菌株BL21(DE3)ΔlexA中，旨在验证组成型表达载体在无抗生素和诱导剂IPTG的条件下，是否能成功表达在诱导型表达载体中原本缺乏酶活性的糖基转移酶蛋白DGAS。实验结果显示，经过改造后的菌株在采用组成型表达载体的情况下，质粒维持率为97%左右，而且无需抗生素和诱导剂IPTG便能实现DGAS蛋白酶活性显著的提升。与常规诱导型表达载体相比，DGAS蛋白酶活性提升了约250倍，这一结果表明组成型表达载体在无需额外添加诱导物的条件下，依然能够高效表达目标蛋白。同时，与正常的组成型表达载体相比，其蛋白的酶活性提升了约1.5倍。 综上，经过功能验证，本实验确认了无抗生素表达系统、高严谨性毒性蛋白表达系统以及高稳定性组成型表达系统各具优势。这些蛋白表达系统为工业发酵 生产蛋白和生物医药应用提供了创新性的思路。
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