摘要
背景 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 （Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）是继SARS-CoV和MERS-CoV后发现的第三种高致病性人畜共患冠状病毒，可造成致命的肺炎，并且引发了全球大流行。目前已累计造成超过7亿人感染和超过七百万人死亡。尤其在 SARS-CoV-2 爆发初期，由于缺乏特效的治疗方法和疫苗，其重症率与致死率较高，亟需开展 SARS-CoV-2 感染者的免疫应答特征研究，阐明新冠感染的致病机制，为临床治疗方法的开发提供理论依据。 开展SARS-CoV-2感染者的外周循环和感染局部的免疫应答特征研究同样必要。以外周血为载体描绘新冠感染者的系统免疫应答图谱，可以及时发现与重症及不良预后相关的因素，快速筛选临床检测可用的指标，指导临床治疗策略。而SARS-CoV-2 主要通过入侵呼吸道感染人体，其导致的肺部症状是发病和致死的主要驱动因素。有效的呼吸道黏膜免疫对于疾病控制至关重要。因此，解析 SARS-CoV-2 感染状态下下呼吸道的免疫状态亦具有重要意义。 目的 描绘SARS-CoV-2感染者的外周免疫应答时空图谱，探索新冠重症的影响因素，探究新冠无症状长阳患者排毒时间延长的机制并提出可能的治疗方法；描绘 SARS-CoV-2 感染者的肺气道区域免疫应答时空图谱，解析感染局部的病毒特异性 T 细胞所发挥的作用。 方法 本研究共纳入了 4 个新冠病人队列，通过采集队列一、队列二和队列三的外周血样本，探索新冠患者外周血循环免疫应答特征；通过采集队列四的支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和外周血样本，描绘新冠患者肺气道区域免疫应答图谱。采用ELISA或电化学发光法检测血浆中SARS-CoV-2结合抗体，使用活病毒免疫斑点形成减少实验检测血浆或BALF上清中的SARS-CoV-2中和抗体。利用流式微球分析（Cytometric Bead Array, CBA）法检测血浆或BALF上清中的细胞因子。利用流式细胞术检测外周血或BALF中的总体免疫细胞组成、SARS-CoV-2 受体结合结构域（Receptor binding domain, RBD）特异性B细胞的比例、SARS-CoV-2特异性T细胞的比例及表型。利用微流控单细胞测序平台（10x Genomics或MobiNova）检测SARS-CoV-2特异性T细胞，分析其表型及功能，并进一步用Smart-seq2单细胞测序平台对B40/N322表位特异性CD8+T细胞进行分析，以验证其表型。 结果 在针对外周血循环免疫应答的研究中，相比新冠轻症患者，重症患者年龄更大，感染早期血浆中的炎症因子和中和抗体水平更高，T细胞应答水平更低，且早期T细胞应答水平与排毒时间呈显著负相关。与轻症或重症患者相比，新冠无症状感染者血浆中的中和抗体、针对新冠不同结构蛋白的结合抗体、针对RBD蛋白的不同亚型抗体水平均较低。新冠无症状长阳者排毒时间的延长与其感染早期血浆中低水平炎症因子和干扰素、低比例的循环滤泡辅助性T细胞（circulating T follicular helper, cTfh）、低水平的特异性T细胞应答相关。在新冠无症状长阳患者接种Ad5-nCoV疫苗后，其外周血中的 cTfh、抗体分泌细胞（Antibody secreting cell, ASC）及 SARS-CoV-2 RBD特异性B细胞比例在2周内迅速升高，SARS-CoV-2中和抗体及结合抗体的滴度亦迅速升高，病毒随即清除。 在针对肺气道感染区域免疫应答的研究中，我们发现相比外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC），BALF中含有更高比例的新冠特异性T细胞。相比外周，BALF的特异性T细胞活化程度更高、分泌细胞因子能力更强、细胞毒性更强、增殖更活跃、存活相关基因表达更强；依赖糖酵解代谢增强其效应功能；高表达耗竭相关基因，但未表现出功能性耗竭，且耗竭相关基因与细胞因子的表达呈显著正相关。BALF中更高比例的特异性T细胞与病毒载量下降、肺功能改善、系统性炎症的减轻显著相关。在病毒清除后，BALF中的特异性T细胞比例增加、功能增强、并进一步分化为组织驻留性记忆性T细胞（Tissue resident memory T cells, TRM）。新冠自然感染与突破感染比较，BALF 的中和抗体水平和 T 细胞应答水平均无显著差异。 结论 本研究的结果表明新冠重症的发生与衰老、高度炎症及受损的T细胞应答相关。新冠无症状感染者仅能产生较弱的抗体应答。新冠无症状长阳者排毒时间的延长可能归结于其受损的抗病毒免疫状态，而在感染期进行疫苗接种能有效帮助其增强新冠特异性应答并清除病毒。高度活化且功能强大的特异性 T 细胞富集在新冠患者肺气道，其通过糖酵解代谢模式增强其效应功能，促进病毒清除以及临床症状的缓解，并在病毒清除后最终分化为TRM，抵御未来的新冠病毒感染。 总体而言，本研究对 SARS-CoV-2 感染者的外周及组织区域免疫应答图谱进行了系统描绘；提出了新冠重症发生及无症状长阳患者排毒时间延长的可能机制；首次在新冠感染中提出治疗性疫苗的概念，并在新冠核酸持续阳性者中验证其有效性；首次深入探究了COVID-19患者肺气道中和抗体与特异性T细胞的特征与功能，填补了新冠病毒特异性肺区域免疫的领域空白，为新的治疗手段开发与未来的疫苗设计提供科学依据。
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