摘要
【研究背景与目的】 鱼藤酮（Rotenone, ROT）具有神经毒性，但其机制远未阐明。研究表明长期接触ROT能诱发神经炎症。细胞焦亡是一种NLRP3介导的程序性细胞死亡方式，能产生强烈的炎症反应。碎片化的高尔基体可以激活 NLRP3介导的炎症反应。同时，锌超载能够促进cGAS-STING通路激活，产生炎症反应。为此，本实验将探讨ROT是否通过诱导HT22细胞焦亡产生炎症反应，并从高尔基体碎片化和锌超载激活cGAS-STING通路两个方面探讨其促细胞焦亡的机制。 【方法】 1. CCK8试剂盒检测HT22细胞活力； 2. Golgi-Tracker Red试剂盒和GM130免疫荧光检测HT22细胞高尔基体碎片化现象； 3. 免疫荧光双标法观察HT22细胞中GRASP65和GM130蛋白共定位现象； 4. 免疫共沉淀法检测HT22细胞中GRASP65与GM130蛋白质相互作用； 5. 蛋白免疫印迹法检测HT22细胞GRASP65、GM130、焦亡相关蛋白 (NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD)、cGAS和STING蛋白的表达； 6. ELISA试剂盒检测HT22细胞培养液上清中白介素-1β和白介素-18的含量； 7. Zinpyr-1荧光探针检测HT22细胞锌离子水平。 【结果】 1. ROT诱导HT22细胞焦亡 ROT (0.5, 1, 2μM, 24 h) 可明显降低HT22细胞活力，上调HT22细胞焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1和GSDMD-N的表达，以及增加细胞培养液上清中白介素-1β和白介素-18的含量，表明ROT可诱导HT22细胞焦亡，具有细胞毒性。 2. ROT诱导HT22细胞高尔基体碎片化 ROT (0.5, 1, 2μM, 24 h) 可使HT22细胞高尔基体膜和高尔基体基质蛋白GM130分布面积增大、GRASP65和GM130的表达及两者的共定位和相互作用下降，表明ROT可诱导HT22细胞高尔基体碎片化。 3. ROT导致HT22细胞锌超载并激活cGAS-STING通路 ROT (0.5, 1, 2μM, 24 h) 可明显上调HT22细胞锌离子浓度以及cGAS和STING蛋白的表达，表明ROT可以导致HT22细胞锌超载并激活cGAS-STING通路。 4. 硫酸锌促使HT22细胞锌超载并激活cGAS-STING通路 锌离子供体硫酸锌 (100, 200, 400μM, 8 h) 可显著上调HT22细胞锌离子浓度以及cGAS和STING蛋白的表达，表明锌超载可以激活HT22细胞cGAS-STING通路。 5. 高浓度硫酸锌对HT22细胞具有细胞毒性 硫酸锌 (100, 200, 400μM, 8 h) 可显著降低HT22细胞活力，表明高浓度硫酸锌对HT22细胞具有细胞毒性。 【结论】 ROT可以导致HT22细胞焦亡，其机制可能涉及高尔基体碎片化和锌超载激活cGAS-STING通路。
NETL