摘要
目的： 血友病A（Hemophilia A，HA）是一种X染色体连锁隐性遗传性出血性疾病，由于F8基因突变导致体内凝血因子Ⅷ活性降低，从而出现一系列凝血功能障碍的表现。在大多数情况下男性发病，女性携带，女性血友病A患者极其罕见。在一般人群中HA发病率为每10万名男性中17.1例，不同国家存在很大的差异。HA患者主要临床表现为自发性关节、肌肉、内脏器官等出血，部分患者仅在外伤、手术时表现为出血不止，严重程度不一，且主要与FⅧ活性水平相关。重型HA患者常因关节腔内反复出血表现为关节肿痛、畸形，最终发展为血友病性关节病。目前主要以外源性凝血因子Ⅷ替代治疗为主，但是频繁输注以及其他一些遗传因素共同作用下可导致凝血因子Ⅷ抑制物的产生，将严重影响疾病的治疗效果。而旁路治疗及单克隆抗体等非因子治疗方案打破了传统的替代治疗，也为抑制物阳性的患者带来新的曙光。 近几年基因治疗得到了快速发展，特别是在遗传性疾病的领域。HA作为一种单基因疾病，是基因治疗的最佳靶点之一。CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现对HA的治疗产生了革命性的重要作用，也为开展HA基础研究提供了新的方向。通过CRISPR/Cas9基因编辑能够纠正基因缺陷，恢复F8基因功能，使HA患者F8基因的表达成为可能，减轻了疾病的负担及痛苦，也可能成为该疾病的潜在治愈方法。 为了探索CRISPR/Cas9基因编辑技术用于血友病A基因治疗的方法，本研究构建并验证了不同的质粒，筛选出用于基因编辑的最佳载体。利用同源定向修复（Homology-directed repair，HDR）及非同源末端连接（Non-homologous end joining， NHEJ）修复方式，将外源性BDD-F8靶向插入了小鼠ROSA26基因组位点，成功实现了F8基因的表达，提高了FⅧ活性，为体内基因编辑治疗提供了一定的研究基础。同时本研究基于真实世界的数据，对单中心血友病A患者的临床资料进行了回顾性总结与分析，显示出HA患者的真实处境，并阐述未来努力的方向，这些对HA今后的研究具有重要的临床意义。 方法： 1. CRISPR/Cas9基因编辑载体构建及验证 （1）我们设计包含5种不同的限制性内切酶序列的BDD-F8-V3片段，合成pUC57-BDD-F8-V3质粒。 （2）通过SalI、KpnI双酶切、连接的方式构建p18T-BDD-F8-V3载体。 （3）在p18T-BDD-F8-V3载体的基础上，使用磷酸化引物环式PCR扩增的方式构建p18T-BDD-F8-SQ载体；在p18T-BDD-F8-SQ载体的基础上，使用磷酸化引物环式PCR扩增的方式构建p18T-BDD-F8-Δ3载体；在p18T-BDD-F8-SQ载体的基础上，使用点突变试剂盒构建p18T-BDD-F8-RH载体。 （4）转染293T细胞，分析F8在mRNA转录及FⅧ蛋白活性的水平，筛选高活性的BDD-F8变体。 （5）通过在线网站（https://zlab.bio/guidedesign-resources）设计靶向mROSA26位点的sgRNA，并通过BpiI酶切、连接的方式构建pX458-spCas9-sgRNA载体。 （6）转染Neuro-2a，48h后进行流式细胞术分选EGFP阳性细胞，对分选后细胞基因组DNA进行PCR扩增，产物进行Sanger测序及T7E1酶切验证sgRNA编辑效率，并分析了潜在脱靶位点的脱靶情况。 （7）使用PCR扩增小鼠ROSA26靶位点两侧的左右同源臂序列，通过双酶切、连接的方式构建HDR供体质粒。 （8）设计合成双切割供体质粒的sgRNA-PAM序列，构建NHEJ供体质粒。 2. 基于CRISPR/Cas9基因编辑增强FⅧ的表达 （1）筛选单克隆细胞株：首先我们在Neuro-2a细胞系中按照1∶2的比例同时转染pX458-mROSA26-int1-sgRNA质粒及HDR/NHEJ供体质粒，转染48h后使用流式细胞术分选EGFP阳性细胞，随后进行嘌呤霉素抗性筛选（药筛），直至出现肉眼可见的单克隆细胞团，挑取并扩大培养单克隆细胞株。 （2）鉴定单克隆细胞株：根据插入的BDD-F8以及PGK-Puro-mcherry片段与mROSA26基因组序列设计特异性引物，PCR扩增两端的接口序列，产物进行纯化并克隆入pMD18-T载体，经过Sanger测序明确鉴定正确整合的单克隆细胞株。 （3）验证单克隆细胞株FⅧ表达：通过分析单克隆细胞株在mRNA转录水平BDD-F8的相对表达量，并检测FⅧ蛋白活性的水平，验证基因编辑的单克隆细胞株能否提高FⅧ的表达。 3. 单中心血友病A患者临床资料总结和分析 （1）通过对在我院血友病综合管理中心登记系统中的资料获取HA患者的基础信息，包括年龄、民族、地域、婚姻状况、最高学历、职业、医保类型、家族史、FⅧ活性、抑制物、基因突变类型等资料。 （2）以电话随访的方式收集患者的临床信息，包括出血表现、年出血频率、首次出血年龄、诊断年龄、靶关节、关节畸形、治疗方案及药物选择。 （3）采用描述性统计方法对患者的人口统计学、临床特征和治疗策略进行总结，利用热图汇总分析HA在山西省的地域分布，组间比较使用配对资料T检验，率的比较使用卡方检验。 结果： 1. CRISPR/Cas9基因编辑载体构建及验证 （1）构建高活性BDD-F8变体质粒 我们使用强启动子EF-1a驱动BDD-F8表达，在生工生物公司合成了含有SalI、BamHI、NotI、NcoI、KpnI 5个限制性内切酶位点的pUC57-BDD-F8-V3质粒。在此基础上成功构建了p18T-BDD-F8-V3 ， p18T-BDD-F8-SQ ， p18T-BDD-F8-∆3和p18T-BDD-F8-RH 四个变体质粒。 （2）筛选高活性BDD-F8变体 在转录水平上 BDD-F8-SQ 组明显高于空白对照组，且与 BDD-F8-V3 ， BDD-F8-∆3，BDD-F8-RH无统计学差异。同时检测了细胞培养基中BDD-FⅧ蛋白的活性，空白组几乎未检测到FⅧ活性，BDD-F8-V3的FⅧ活性水平显著增高，与BDD-F8-SQ相比差异有统计学意义，而BDD-F8-∆3、BDD-F8-RH组与BDD-F8-SQ组相比，差异无统计学意义。 （3）构建pX458-spCas9-sgRNA 使用在线网站输入打靶序列，设计靶向mROSA26内含子1位点的单导RNA （Single guide RNA，sgRNA）序列，并将两个sgRNA成功克隆到pX458质粒中，命名为pX458-mROSA26-int1-sgRNA1和pX458-mROSA26-int1-sgRNA2。 （4）验证sgRNA切割效率及脱靶 Sanger测序结果显示我们设计构建的sgRNA在基因组DNA的靶位点能够发生双链DNA裂解，并在修复过程中出现基因错配，导致PAM序列上游三个碱基处开始出现了套峰。T7E1酶切结果显示这两个sgRNA均可特异性靶向并切割mROSA26位点，其中mROSA26-int1-sgRNA1的错配率最高，靶向切割能力最强。脱靶分析结果显示在潜在的脱靶位点上没有发现切割错配事件。 （5）成功构建HDR/NHEJ供体质粒 我们在p18T-BDD-F8-V3的基础上构建HDR/NHEJ供体质粒，两个供体质粒均有PGK-Puro-mcherry ， HDR供体质粒含有左右同源臂， NHEJ供体质粒两侧为sgRNA-PAM序列。根据不同的酶切位点插入序列，SalI、BanHI中间连接左侧同源臂或左侧sgRNA-PAM序列，NotI、NcoI中间连接PGK-Puro-mcherry筛选标记， NcoI、KpnI中间连接右侧同源臂或右侧sgRNA-PAM序列。通过酶切及Sanger测序验证表明我们成功构建了HDR/NHEJ供体质粒。 2. 基于CRISPR/Cas9基因编辑增强FⅧ的表达 （1）单克隆细胞株在mROSA26位点发生基因整合 我们基于HDR方式将外源性BDD-F8及PGK-Puro-mcherry插入基因组位点仅存在一种整合方式，而NHEJ使用双切割供体载体，能够通过正向及反向插入基因组靶位点。通过扩增HDR/NHEJ单克隆细胞基因组整合接口两侧的特异性序列（一部分为基因组序列，一部分为插入的基因序列），回收并纯化目标条带，可见单一的目的条带，Sanger测序的结果进一步证实了BDD-hF8在靶位点的成功整合。 （2）通过基因编辑提高FⅧ表达 我们观察到，以空白细胞为对照，基因编辑的细胞克隆（pD-NHEJ+sgRNA-Cas9组及pD-HDR+sgRNA-Cas9组） mRNA转录水平显著增加，而阴性对照组（仅sgRNA-Cas9、仅 HDR-Donor 和仅 NHEJ-Donor）未检测到 F8 转录本的表达。此外，pD-NHEJ+sgRNA-Cas9组及pD-HDR+sgRNA-Cas9组FⅧ蛋白活性水平高达10-15%，而阴性对照组与空白细胞水平相当。因此，基因编辑显著提高了Neuro-2a细胞中FⅧ的表达。 3. 单中心血友病A患者的临床资料总结和分析 （1）人口统计学资料 我们共收集了662例HA患者信息，其中661例男性，407例汉族，120例儿童， 96例已婚，61例无业，57例为职工医保，87例有大学及以上学历，116例有已知的HA家族史。97.7%患者均来自于山西省，分布热图显示出省会城市太原HA患者数量最多，其他城市HA患者数量相对较少。 （2）临床特征分析 根据FⅧ活性水平，本研究中385例（58.1%）重型HA，180例（27.2%）中间型HA，86例（13.0%）轻型HA。HA患者抑制物阳性率为20.5%，重型HA比例为23.9%，中间型HA比例为17.6%，轻型HA比例为6.7%，不同的疾病严重程度的患者抑制物均以高滴度者为主。其中221例患者进行了基因检测，104例（46.8%）患者内含子22倒位，是最多见的基因突变类型，其他突变依次是错义突变、无义突变、缺失、插入、内含子1倒位、剪接位点突变等类型。 对患者进行随访发现多数患者肌肉为首次出血最常发生的部位，占28.9%。随着年龄的增长，目前主要出血部位是关节。在首次发病时，163例患者及时诊断，多数发生在婴儿或幼儿时期，且106例（65%）为重型HA，其余患者存在不同程度的诊断延迟。轻型HA平均延迟时间可达16.7年，中间型HA平均延迟时间为11.9年，重型HA平均延迟时间为8.8年，重型HA与中间型/轻型HA之间平均延迟时间差异具有统计学意义。166例患者存在靶关节，主要发生在膝关节、踝关节、肘关节等大关节，且134例发生关节畸形，在重型HA患者中关节畸形率达56.3%。目前患者的年出血频率以0-5次者居多。在治疗基础上重型HA年出血频率比中/轻型HA高。 （3）治疗策略总结 对随访301例患者的治疗情况进行总结，132例（43.9%）接受按需治疗，131例采用（43.5%）预防治疗，重型HA患者预防治疗比率最高，多数患者采取每周2-3次治疗方案，38例（12.6%）未使用任何治疗方案。在凝血因子FⅧ产品选择上有所不同，96例（36.5%）使用血源性凝血因子FⅧ，129例（49%）使用重组凝血因子FⅧ，34例（12.9%）患者血源及重组凝血因子FⅧ均使用过，2例（0.8%）抑制物阳性患者正在使用凝血酶原复合物治疗。通过比较血源及重组的凝血因子Ⅷ治疗HA抑制物发生率，结果无统计学意义。 结论： 1. 成功构建了 p18T-BDD-F8-V3、p18T-BDD-F8-SQ、p18T-BDD-F8-∆3 和p18T-BDD-F8-RH 四个变体质粒，并验证出BDD-F8-V3具有最高的FⅧ活性。 2. 成 功 构 建 了 pX458-mROSA26-int1-sgRNA 质 粒，经 过 鉴 定 发 现pX458-mROSA26-int1-sgRNA1靶向切割能力最强，且潜在脱靶位点未发现脱靶事件。 3. 构建了基因编辑的HDR/NHEJ供体质粒，检测到BDD-F8-V3在mROSA26基因组位点的成功整合。 4. CRISPR/Cas9基因编辑技术能够显著提高Neuro-2a细胞中FⅧ的表达，在细胞水平上实现了外源性基因敲入，纠正了基因缺陷，对多种单基因疾病的研究和治疗具有重要的意义。 5. 基于真实世界的数据总结了山西省单中心HA患者的人口统计学、临床特征及治疗策略，显示了本地区HA患者的诊疗现状，具有重要的临床意义。
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