摘要
目的：肺癌是全球癌症死亡的最主要原因。研究发现表皮生长因子受体（EGFR）在 80%以上的非小细胞肺癌（NSCLC）中高表达。因此，针对这一靶点的分子靶向治疗在NSCLC的治疗中取得了显著的疗效，尤其是有19外显子缺失突变和21外显子点突变（L858R）的患者。但最终多数患者会对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）产生耐药。目前，已经发现了多种 EGFR 敏感突变的 NSCLC 对EGFR-TKIs 的获得性耐药机制。虽然研究发现 EGFR 野生型的NSCLC患者也能对EGFR-TKIs的单药治疗有良好的收益，但EGFR野生型的 NSCLC 对 EGFR-TKIs 的耐药机制鲜有报道。本课题旨在研究EGFR野生型的NSCLC 细胞对EGFR-TKI吉非替尼的获得性耐药机制，为改善肿瘤的靶向治疗提供参考。 方法：（1）采用不同浓度的吉非替尼（5-40 μmol/L）处理 A549和A549/GR细胞，CCK8法检测细胞的活力；对A549/GR细胞进行耐药机制的筛查：使用一代测序技术检测EGFR基因的T790M突变、荧光原位杂交法检测 EGFR 基因的染色体外扩增以及 qPCR 检测MET基因和PTEN基因相对于A549细胞的表达；（2）将不同浓度的吉非替尼和MET酪氨酸激酶抑制剂PHA-665752单独或联合应用于A549/GR细胞，CCK8法检测细胞的活力，Hoechst染色法和TUNEL法检测细胞的凋亡变化，Western blot 检测EGFR、p-EGFR、MET、p-MET、AKT、p-AKT蛋白表达的变化；（3）使用MET特异性siRNA敲低 A549/GR 细胞 MET 的表达，Western blot 检测吉非替尼处理下MET、EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT表达的变化，CCK8法检测不同浓度吉非替尼处理下细胞的活力；在 A549 细胞中过表达 MET， Western blot 检测吉非替尼和 MET 抑制剂单独或联合应用于 A549 细胞时 MET、AKT、p-AKT 表达的变化，CCK8 法检测不同浓度吉非替尼处理下细胞的活力。 结果：（1）在A549/GR细胞中未出现EGFR基因的T790M突变和染色体外扩增。相比于A549细胞，PTEN基因的表达没有显著变化，但是MET基因的表达显著上调。（2）A549/GR细胞对吉非替尼和MET抑制剂单独耐药，但是两药的联合处理显著抑制了A549/GR细胞的生长并且诱导了A549/GR细胞的凋亡。吉非替尼联合MET抑制剂完全抑制住了在它们单独应用于 A549/GR 细胞时所不能抑制的AKT的磷酸化。（3）MET特异性siRNA敲低A549/GR细胞MET的表达导致AKT的磷酸化在吉非替尼的单独作用下受到显著抑制，并且细胞的生长也被重新抑制。通过携带MET基因的慢病毒感染A549细胞上调MET的表达后，吉非替尼不再能单独抑制AKT的磷酸化，并且A549细胞对吉非替尼产生了耐药性。 结论：EGFR 野生型的 A549 细胞通过上调 MET 的表达来维持AKT的持续活化来发展对吉非替尼的获得性耐药。
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