摘要
炎症对人体有着复杂的影响，长期或者过度的炎症有概率导致多种慢性疾病例如动脉粥样硬化，肿瘤，机体持续性损伤如关节炎，肝炎，还可能导致自身免疫疾病。为了有效控制炎症，研究者们开发了多种抗炎产物。天然抗炎产物（神经酰胺、红没药醇、姜黄素等）相较于人工合成的抗炎药物（布洛芬、阿司匹林等），天然抗炎产物具备安全性高、耐药风险低、获取容易且兼具其他功效等优点。然而传统的天然抗炎产物制备方法例如提取法，化学合成法等往往存在多种弊端：动植物提取的产物通常产量较低，对环境不友好，动物提取产物还可能携带病毒；化学合成的产物可能存在同分异构体。而微生物法生产天然抗炎产物的生产率高，生产过程可控性强，且微生物资源丰富，环保，符合可持续发展的理念，后续还可通过优化工艺方案提高产量降低生产成本。 本文研究了神经酰胺与红没药醇两种具有抗炎活性天然产物的微生物制取法。从葡萄和苹果中筛选出一株可用于生产神经酰胺的酵母菌，从水稻基因组中选取了一段红没药醇合成酶（ORBBS）的基因，将该基因构建在 pGEX-6P-1-Ecoli.BL21（DE3）表达载体上进行诱导表达。该篇论文的主要结论如下： (1) 本课题使用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD, Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）培养基从自购的苹果和葡萄中筛选出 4 株酵母菌，培养后使用氯仿和甲醇提取脂质，经薄层层析法（TLC, Thin-Layer Chromatography）检测初步判断该酵母菌中含有神经酰胺，挑选了一株菌作为研究对象，经硅胶柱层析分离后得到分离产物，使用傅里叶红外光谱（FTIR, Fourier Transform infrared spectroscopy)检测发现在 1550 cm-1-1640 cm-1 处有吸收峰，进一步证明该酵母菌中含有神经酰胺。 (2) 分别采用高效液相色谱串联紫外（HPLC-UV），高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS），气相色谱串联质谱（GC-MS）对红没药醇进行分析。HPLC-MS检测红没药醇的结果表明，在 16.7 min 与 18.3 min 附近处有吸收峰，依照峰面积绘制标准曲线，各样品浓度与峰面积成良好的线性关系。HPLC-MS未找到对应分子量的样品，GC-MS检测发现 14.6 min有明显的吸收峰。综合实验结果最终选择GC-MS作为酶活检测方法。 (3) 将 ORBBS 构建在 pGEX-6P-1 载体并导入进 Ecoli.BL21（DE3）宿主细胞上，经琼脂糖凝胶电泳实验证明目的基因导入成功，进行蛋白诱导表达后发现在 92 kDa 处出现条带，红没药醇合成酶表达成功，进一步构建酶活测定体系，GC-MS测定红没药醇浓度为 21.14 μg/L。
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