摘要
扩展青霉(Penicillium expansum)是一种重要的采后病原真菌，可侵染水果从而引起果实青霉病，造成较大的经济损失。其产生的次级代谢产物棒曲霉素(Patulin，PAT)具有致畸、致癌、致突变的作用，对人类健康造成了严重的威胁。LaeA 基因最初是在构巢曲霉中鉴定到的，后来发现它是广泛存在于丝状真菌基因组中的一个高度保守的基因。有研究表明LaeA作为全局调控因子参与丝状真菌生长发育及次级代谢等众多生物学过程。本研究利用生物信息学、反向遗传学、转录组学等分析方法，对 P. expansum T01 中 PeLaeA 的功能进行了研究。主要结果如下： (1) 经生物信息学分析发现PeLaeA启动子中存在12种顺式作用元件(NIT2、ABAA和GAL4等的识别结合元件)，表明 PeLaeA的转录表达可能受糖代谢、氮源代谢和应激响应等众多过程调控；LaeA 是一个具有甲基转移酶活性的亲水性蛋白，有多个磷酸化位点，定位于细胞核内，推测PeLaeA自身参与众多生物学过程。 (2) 以同源重组、农杆菌介导的方法构建得到三株 PeLaeA 敲除突变菌株ΔPeLaeA4、ΔPeLaeA5、ΔPeLaeA6；以农杆菌介导的 T-DNA 随机插入的方式构建了三株PeLaeA回复表达株ΔPeLaeA-C1、ΔPeLaeA-C3、ΔPeLaeA-C4，以及三株PeLaeA过表达株PeLaeA-OE1、PeLaeA-OE2、PeLaeA-OE5。并且亚细胞定位分析表明：PeLaeA定位于细胞核中。 (3) 相较于野生型，PeLaeA 敲除突变菌株的菌落直径及生物量增加，菌落颜色变浅，菌丝体更细长，分生孢子梗数量减少，孢子萌发及菌丝体生长加快，产孢量下降，孢子形成相关基因PeAbaA、PeBrlA以及PeWetA的表达水平下降。表明PeLaeA对P. expansum T01菌株菌丝体营养生长及孢子萌发具有负向调控的作用，且PeLaeA通过调控孢子发生相关基因的表达正向调控孢子的形成。 (4) 在P. expansum T01 感染早期，ΔPeLaeA 病斑直径增加，表明其致病力更强。可能的原因是ΔPeLaeA产生了更高的与致病性相关的内切-β-1,4-葡聚糖酶以及总淀粉酶。 (5) 菌丝生长环境中 pH 总体呈先下降后上升的趋势，ΔPeLaeA 生长环境中pH 整体高于野生型、ΔPeLaeA-C 及 PeLaeA-OE，环境 pH 相关基因 PacC 在ΔPeLaeA 中的表达量显著上升。同时 ΔPeLaeA 表现出更高的还原糖消耗，可能是由于其菌丝体营养生长导致的碳源代谢加快。 (6) ΔPeLaeA侵染苹果后腐烂组织以及ΔPeLaeA生长环境中检测不到PAT的积累；ΔPeLaeA-C及PeLaeA-OE处理组中PAT的积累有所恢复但并未回复到野生型水平；ΔPeLaeA中PAT合成基因簇的15个基因表达水平均下调。表明PeLaeA通过调控PAT合成基因簇的表达来调控PAT的合成和积累。 (7) 转录组分析显示 PeLaeA 敲除后得到了 901 个差异表达基因。其中 13%的上调基因和35%的下调基因参与调控了 P. expansum T01 生长发育及次级代谢的许多通路。 综上所述PeLaeA是一个细胞核质定位并且可能具有甲基转移酶活性的蛋白。PeLaeA 参与调控了 P. expansum T01 菌株的菌落形态、菌丝体生长、孢子发生、孢子萌发以及次级代谢等众多生物学过程。
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