摘要
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称猪“蓝耳病”， 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的以怀孕母猪繁殖障碍及各年龄阶段 猪呼吸道疾病为主要特征的危害世界养猪业的重要疫病。2006年我国南方一些省份的猪场暴发了 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病，给我国养猪业造成了严重的经济损失。PRRSV进化导致病毒 抗原性、嗜性和致病性等表型发生变异，这给临床PRRS的防控带来了巨大的挑战。为了深入理 解PRRSV表型变异的分子基础，进而研制出更有效的疫苗，本研究利用真核聚合酶Ⅰ和Ⅱ启动 子和终止子，结合核酶，构建了 PRRSV真核拯救系统;利用慢病毒包装和转导技术建立了稳定 表达T7RNA聚合酶的Mark-145细胞系。通过上述不同方法，来试图建立PRRSV体内拯救系统。 为了获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)弱毒株的全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆，根 据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株(EF635006)和经典PRRSV的CH-1a株(AY032626)全 基因组序列，设计并合成特异引物，用RT-PCR分6段扩增了 HP-PRRSV弱毒株的全基因组。将 扩增的各个cDNA重叠片段分别克隆到PMDT-20载体中，建立了 PRRSV弱毒株的初级cDNA克 隆，并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果，选择特异的酶切位点，将各个亚克隆产 物逐段克隆入经过改造过的低拷贝pOK12载体中，通过引入MluⅠ和EcoRⅠ酶切位点将聚合酶Ⅱ、 Ⅰ和T7启动子序列和榔头锤酶基因(Hammerhead ribozyme，HamRz)置于病毒基因组5''端;通 过引入NotⅠ和FseⅠ酶切位点将聚合酶Ⅱ、Ⅰ终止子序列和戊型肝炎病毒核酶(Hepatitis delta virus ribozyme,HdvRz)基因置于病毒基因组3''端，结果得到了病毒基因组全长cDNA克隆 ppAPRRSVOK12,该质粒可以利用真核细胞的聚合酶系统转录PRRSV的全长cDNA,也可以利 用T7 RNA聚合酶系统进行转录。通过直接转染Marc-145细胞来拯救病毒，利用传代培养、RT-PCR 等鉴定，没有拯救出感染性病毒。 为了建立表达T7 RNA聚合酶的Marc-145细胞系，利用T7 RNA聚合酶体内拯救病毒，我们 利用慢病毒包装和转导技术建立了稳定表达T7 RNA聚合酶的Marc-145-T7细胞系。先克隆出T7 RNA聚合酶基因，将其定向克隆入慢病毒载体PLVX-puro中，得到阳性重组质粒pLVX-Puro-T7。 共转染293T细胞，获得含有T7 RNA聚合酶基因的假型病毒。然后将假型病毒感染Marc-145细 胞，把T7 RNA聚合酶基因整合进Marc-145细胞基因组中。通过G418和嘌呤霉素抗性筛选，获 得了稳定表达具有转录活性的Marc-145-T7细胞系，通过PCR、RT-PCR、SDS-PEAG等技术进行 鉴定，结果表明，T7 RNA聚合酶基因已经被稳定地整合进Marc-145细胞基因组中，并且该细胞 系内的T7 RNAP具有较好的转录活性，其活性传代不减弱。最后，利用建立的Marc-145-T7细胞 系对HP-PRRSV弱毒株全长cDNA分子进行拯救，结果表明，没有获得具有感染性的病毒。虽然 没有得到具有感染性的病毒粒子，但是我们从中也收获许多，正确客观地分析没有得到具有感染 性的病毒粒子的原因可以为后续试验的改进和优化指明方向。
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