摘要
阿霉素是一种蒽环类抗肿瘤药物，在治疗肿瘤的过程中有潜在的心脏毒性，可诱发急性和慢性心肌病，并可导致癌症患者充血性心力衰竭。近年来临床研究和动物实验发现阿霉素可致心脏质量下降，心肌萎缩及心功能降低。然而，阿霉素诱导心肌萎缩的机理尚未完全阐明。前期研究发现在阿霉素诱导心肌病时心肌活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平增加。NADPH氧化酶是心血管细胞中ROS的主要来源之一，NADPH氧化酶2（Nox2）是NADPH氧化酶重要的亚单位。Nox2在阿霉素诱导病理性心肌重构中发挥重要作用。然而，NADPH氧化酶2是否介导阿霉素诱导心肌萎缩及其机制迄今尚未阐明。 近年来，我们和其他组的研究表明，慢性心力衰竭时心脏交感神经末梢分布密度减少和功能降低。在阿霉素诱导心肌病患者和动物模型中，心肌PGP9.5（Protein gene product 9.5，一种神经纤维轴突蛋白）染色的神经纤维数量减少和酪氨酸羟化酶蛋白表达降低，提示心脏交感神经末梢分布密度减少及功能降低。心脏交感神经在心肌细胞营养中起着十分重要的作用。然而，阿霉素诱导心肌病时心脏交感神经末梢减少是否与心肌萎缩有关尚不清楚。据报道心肌NADPH氧化酶激活和氧化应激增加介导心力衰竭时心脏交感神经末梢分布减少和功能异常。在阿霉素诱导心肌病中，NADPH氧化酶2源性 ROS是否介导心脏交感神经末梢减少和功能异常，进而导致心肌萎缩目前不清楚。心肌细胞自噬在维持正常心肌细胞大小、心脏结构和功能中起重要作用。自噬水平不足或增加与心肌重构和心功能不全有关。在阿霉素诱导心肌病中，心肌细胞自噬、NADPH 氧化酶活性及氧化应激均增加。然而， NADPH氧化酶2是否介导阿霉素诱导心肌细胞自噬，促进心肌萎缩和心功能降低目前不清楚。 本研究我们建立阿霉素诱导急性和慢性心肌病小鼠模型，采用Nox2基因敲除小鼠和新型特异性NADPH氧化酶2抑制剂GSK2795039，验证这个新的科学假设：NADPH氧化酶2介导阿霉素诱导心肌病心脏交感神经末梢异常和心肌细胞自噬，进而导致心肌萎缩和心功能降低。 目的： （1）采用NADPH氧化酶2基因敲除小鼠，探究是否NADPH氧化酶2通过介导阿霉素诱导心肌病心脏交感神经末梢异常及心肌细胞自噬，进而导致心肌萎缩及心功能障碍。（2）使用新型特异性NADPH氧化酶2抑制剂GSK2795039，在阿霉素诱导慢性心肌病小鼠模型上，观察是否药物特异性抑制NADPH氧化酶2减轻阿霉素诱导心肌病心脏交感神经末梢异常及心肌细胞自噬，进而改善心肌萎缩及心功能。 方法： 实验分为两部分： 第一部分：8-10周龄野生型小鼠与NADPH氧化酶2（Nox2）基因敲除小鼠随机分为四组：野生型小鼠+生理盐水组（n=11）、Nox2 基因敲除小鼠+生理盐水组（n=12）、野生型小鼠+阿霉素组（n=22）、Nox2基因敲除小鼠+阿霉素组（n=19）。阿霉素组的小鼠一次性腹腔注射阿霉素（15mg/kg）建立阿霉素诱导急性心肌病模型，生理盐水组小鼠一次性腹腔注射0.5mL的0.9%氯化钠注射液。1周后给小鼠行超声心动图检查，测定左心室壁厚度、左室收缩末期内径、左室舒张末期内径及左心室缩短分数。然后对小鼠实施安乐死后称取心脏、肝脏和肺脏的重量，量取左侧胫骨的长度，左心室组织用于组织学和生物化学等指标检测。蔗糖-磷酸钾-乙醛酸法测定心脏去甲肾上腺素组织荧光含量；苏木精和伊红染色测定心肌细胞的横截面积；马松染色观察心肌纤维化的程度；免疫组化染色测定心肌氧化应激指标8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHdG）；免疫组化或 Western Blotting检测交感神经标志物PGP9.5、酪氨酸羟化酶、生长相关蛋白-43（GAP43）和去甲肾上腺素转运蛋白的蛋白表达，调控细胞生长信号通路ERK、磷酸化ERK（p-ERK）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、S6、磷酸化 S6（p-S6）的蛋白表达，自噬相关蛋白的指标 LC3、Beclin1、Atg5、Atg12和Atg5-Atg12偶联物的蛋白表达，凋亡指标Bcl-2、Bax、Caspase3和cleaved caspase3的蛋白表达。最后对数据进行统计学分析。 第二部分：实验选用8-10周龄C57BL/6J小鼠，建立阿霉素诱导慢性心肌病小鼠模型。小鼠随机分为四组：生理盐水组（0.5mL，每日一次，腹腔注射，9 周） （n=7），GSK2795039组（2.5 mg/kg，每日两次，灌胃，9周）（n=7）,阿霉素组（2.5 mg/kg，隔日一次，总共6次，腹腔注射）（n=10）,阿霉素（2.5 mg/kg，隔日一次，总共 6 次，腹腔注射）+ GSK2795039（2.5 mg/kg，每日两次，灌胃，9周）组（n=10）。在第9周最后一天给小鼠行超声心动图检查，实验末对小鼠实施安乐死后称取心脏等器官重量，左心室组织用于组织学和生物化学等指标检测，测定方法同上。 结果： 在阿霉素诱导急性心肌病小鼠模型中，我们发现：（1）Nox2 基因敲除可改善小鼠的存活率，减轻左心室壁厚度、心脏重量与左胫骨长度比值和左心室缩短分数的下降以及肺湿重与干重比值的增加；（2）Nox2 基因敲除减轻心肌氧化应激指标 8-OHdG 增加；（3）Nox2 基因敲除减轻心脏去甲肾上腺素组织荧光减少，心肌PGP9.5、GAP43、酪氨酸羟化酶和去甲肾上腺素转运蛋白表达降低；（4）Nox2 基因敲除减轻心肌细胞横截面积减少和心肌p-ERK、p-Akt及p-S6蛋白表达降低；（5） Nox2基因敲除减轻心肌LC3Ⅱ、Beclin1、Atg5、Atg12和Atg5-Atg12偶联物蛋白的增加；（6）Nox2基因敲除减轻心肌抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，凋亡蛋白Bax表达增加和cleaved caspase3（caspase 3 活性指标，凋亡指标）蛋白表达的增加。这些结果表明Nox2基因敲除减轻阿霉素诱导急性心肌病时心脏交感神经末梢密度降低和心肌细胞自噬增加，改善心肌萎缩与心功能。提示Nox2源性氧化应激介导阿霉素诱导的心脏交感神经末梢密度降低，心肌细胞自噬和凋亡增加，进而导致心肌萎缩和心力衰竭。 在阿霉素诱导慢性心肌病小鼠模型中，我们发现：（1）新型特异性Nox2抑制剂 GSK2795039 减轻左心室室壁厚度、左室收缩末期容积和左室射血分数的降低；（2）GSK2795039 减轻心脏重量与胫骨的长度比值降低和心肌细胞横截面积减少；（3）GSK2795039预防心肌gp91phox（Nox2）蛋白表达和4-羟基壬烯醛（4-HNE，氧化应激指标）水平增加；（4）GSK2795039预防心肌GAP43、酪氨酸羟化酶和去甲肾上腺素转运蛋白表达水平降低；（5）GSK2795039减轻心肌LC3Ⅱ/I比值、Atg5、Atg12和Atg5-Atg12偶联物蛋白表达增加以及P62蛋白表达的降低。这些结果表明新型特异性Nox2抑制剂GSK2795039减轻阿霉素诱导慢性心肌病时心脏交感神经末梢减少和心肌细胞自噬增加，改善心肌萎缩及心功能。进一步提示NADPH氧化酶2激活介导阿霉素诱导慢性心肌病时心脏交感神经末梢密度减少和心肌细胞自噬增加，进而导致心肌萎缩及心力衰竭。 结论： 在阿霉素诱导急性心肌病小鼠模型中，心肌氧化应激增加、心脏交感神经末梢分布密度减少、心肌细胞自噬和凋亡水平增加、心脏重量和左心室收缩功能降低。Nox2 基因敲除减轻阿霉素诱导心脏交感神经末梢异常及心肌细胞自噬和凋亡水平的增加，改善心脏萎缩和心功能的降低。提示Nox2介导阿霉素诱导急性心肌病心脏交感神经末梢异常和心肌细胞自噬，进而导致心脏萎缩和心功能降低。在阿霉素诱导慢性心肌病小鼠模型上，特异性Nox2抑制剂GSK2795039减轻阿霉素诱导心脏交感神经末梢密度减少和心肌细胞自噬增加，改善心肌萎缩和左心功能不全。提示在慢性阿霉素治疗中，NADPH氧化酶2激活介导心脏交感神经末梢减少和心肌细胞自噬，进而导致心肌萎缩和心功能不全。本研究结果提示通过抑制NADPH氧化酶，改善心脏交感神经末梢分布或调节心肌细胞自噬水平，可为预防阿霉素诱导心肌萎缩和心功能不全提供新的见解和治疗靶点。
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