摘要
猫病毒性呼吸道感染的病原主要包括猫疱疹病毒（Feline herpesvirus type Ⅰ，FHV-Ⅰ）、猫杯状病毒（Feline calicivirus，FCV）和猫冠状病毒。其中，主要病原是 FHV-Ⅰ和 FCV。FHV-Ⅰ造成的呼吸道感染表现为打喷嚏、流鼻涕和结膜炎等症状。该病毒只有一种血清型，并且在遗传上相对同质。FHV-Ⅰ为典型的 α 疱疹病毒，该病毒具有噬神经质的潜伏感染的特性，临床恢复的猫可成为病原的隐性携带者。FCV 感染是一种多发性口腔和呼吸道传染病，也被称为猫流行性感冒、猫传染性鼻结膜炎等，各年龄段猫均可感染，2~3 月龄幼猫最易感，并且 FCV的 RNA基因组极易发生变异，近年来，FCV变异株在国内外被分离，给 FCV感染的防控带来巨大挑战。由于 FHV-Ⅰ常与 FCV 混合感染，难以进行鉴别诊断，且随着 FCV变异毒株的增多，迫切需求猫呼吸道感染病原体的核酸检测方法。 本项研究针对 FHV-Ⅰ CIRC 基因、FCV ORF1 和 ORF2 基因，设计了一套特异性引物与探针。通过对 PCR 反应体系及条件的精细优化，建立了一种高效准确的双重 TaqMan 荧光定量 PCR检测方法。特异性结果表明，该方法能够特异检测 FCV和 FHV-Ⅰ，而不与猫细小病毒（Feline parvovirus，FPV）、猫冠状病毒（Feline coronavirus，FCoV）发生交叉反应。对 22份 FHV参考阳性样品、22份FCV参考阳性样品与 10份 FHV-Ⅰ和 FCV参考阴性样品进行检测，阳性率为 100%。通过对 pMD18-T-FHV-Ⅰ和 pMD18-T-FCV 重组质粒进行灵敏度检测，确定了最低检出极限为 1.0×101 copies/μL。针对引物靶位点区间，该方法对所有已知变异位点的 FCV 毒株 ORF1 和 ORF2 基因人工合成质粒最低检出极限为 1.0×101 copies/μL，对本实验室保存的不同变异位点的 FCV 毒株，最小检出范围在 1.0×102-1.0×103 copies/μL 之间。组内和组间的重复性检测结果表明变异系数均在 3%以下，该方法可靠稳定。本研究建立的双重 TaqMan荧光定量 PCR方法对 69个样本进行检测，检测样品57个样品呈 FCV阳性，53 个呈 FHV-Ⅰ阳性，而用 SYBR Green Ⅰ 荧光定量 PCR 分别检测样品 54 份 FCV 阳性和 48份 FHV-Ⅰ阳性。本研究建立的双重 TaqMan荧光定量 PCR检测方法特异、灵敏及广谱，可高效检测FCV与FHV-Ⅰ感染，为猫呼吸道感染的防控奠定了基础。 构建了表达 FHV-Ⅰ gD 蛋白的重组质粒 pET-32a-gD，利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了 gD 蛋白。纯化后的 gD 蛋白免疫 BALB/c 小鼠，获得了分泌 gD 蛋白抗体的脾细胞。融合小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞，间接免疫荧光法进行阳性杂交瘤的筛选。蛋白印迹鉴定单克隆抗体的特异性，构建 gD 蛋白截短体鉴定单克隆抗体识别的表位区域。结果显示，成功筛选了 2株稳定分泌 gD蛋白抗体的杂交瘤细胞株:1C8-A1和 2F8-B2，均可与 FHV-Ⅰ产生特异性反应。鉴定出 gD蛋白2个抗原表位，分别为 224LDGARDYHYYWVPYNPQP241和 260VRF QEAI266。本研究结果为FHV-Ⅰ检测和gD蛋白功能研究提供了重要工具。
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