摘要
目的： 雄激素脱发（Androgenic alopecia，AGA）是一种常见的脱发疾病，且近年来呈年轻化趋势，AGA 的治疗需求也在持续上升。将治疗 AGA 的首选药物米诺地尔（Minoxidil，MXD）载入传递体中，可以显著提高其经皮渗透和疗效。为了有效提高传递体的载药量和稳定性，增强其对 AGA 的治疗效果，本文利用“药物-环糊精（Cyclodextrin，CD）-传递体”这一药物递送载体，结合环糊精的增溶作用与传递体促经皮渗透的优势，制备一种载药量高、稳定性好的包合物传递体（MXD/SCD@TFs）。采用分子对接和相溶解度法结合筛选适合 MXD的最优 CD后制备MXD包合物，进一步制备MXD/SCD@TFs。对MXD/SCD@TFs理化性质、稳定性、变形性、离体豚鼠皮肤经皮渗透性进行考察，并对其治疗 AGA 的效果进行评价。研究结果为提高MXD治疗AGA的疗效提供了一种新策略。 方法： 1. 通过密度泛函理论和半经验算法，利用高斯 09 软件搭建并优化 MXD、β-CD 及其 11 种衍生物的结构。基于拉马克遗传算法，采用 AutoDock 软件对优化后的 MXD 与 12 种 CD 进行对接，PyMOL 软件对结果进行可视化分析，以结合能（Eob，Kcal·mol-1）为指标，筛选适合 MXD的 CD。利用 Gromacs 2022软件对筛选得到的 CD 与 MXD 结合的最优构象进行分子动力学模拟以验证其结构稳定性；以羟丙基-β-CD（HP-β-CD）为对照，利用相溶解度图对分子对接的结果进行实验验证，并对包合物的化学计量比进行探究。 2. 利用冷冻干燥法制备 CD 和 MXD 的包合物。采用扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）、差示扫描量热法（Differential scanning calorimetry ， DSC ） 以及傅里叶变换红外光谱 （ Fourier Transform infraredspectroscopy，FT-IR）对MXD、CD、物理混合物和包合物进行表征，以确认包合物是否成功制备。 3. 采用薄膜分散法，将包合物溶解在水相中制备包合物传递体。以包封率（Encapsulation efficiency，EE）和粒径为考察指标，通过单因素法优化得到最佳制备处方（ MXD/SCD@TFs ）。以 MXD 代替 MXD 包合物制得的普通传递体（MXD@TFs）作为对照，对 MXD/SCD@TFs的性质进行考察，包括外观、粒径、多分散性指数（PDI）、Zeta 电位、包封率、载药量（Drug loading，DL）和 pH，并用扫描电镜（Transmission electron microscope，TEM）观察微观形态。 4. 以 MXD@TFs为对照，在 6000 rpm下离心 20 min，考察 MXD/SCD@TFs物理稳定性。将两种制剂分别在（4 ± 1）℃和（25 ± 1）℃下密封保存 28天，以外观、粒径、PDI、Zeta电位、EE、DL为指标，考察MXD/SCD@TFs的化学稳定性。 5. 在 MXD@TFs和 MXD/SCD@TFs制备过程中不添加 Tween 80制得相应的脂质体 MXD@Lip 和 MXD/SCD@Lip ，分别测定 MXD@Lip、MXD@TFs、MXD/SCD@Lip、MXD/SCD@TFs 的变形性，考察 CD 和边缘活化剂对制剂变形性的影响。 6. 制备与 MXD@TFs 有相同 MXD 含量的包合物传递体（MXD/SCD@TFs-2），通过比较 MXD/SCD@TFs-2、MXD/SCD@TFs、MXD@TFs 经离体豚鼠皮肤的药物稳态渗透速率（Jss，μg·cm-2·h-1）和 MXD 的皮肤滞留量（DR，μg·cm-2），考察 CD和DL对MXD经皮渗透性的影响。 7. 以 C57BL/6小鼠为模型动物，连续 21天以 1 mL/cm2的剂量涂抹 2%（w/v）睾酮乙醇溶液（睾酮溶于 50%乙醇溶液）诱导建立 AGA 模型。以模型组和局部应用生理盐水组为对照，考察三个治疗组即局部应用市售的米诺地尔酊剂（MT）、MXD@TFs、MXD/SCD@TFs的小鼠背部毛发的生长状况，并对治疗21天后的皮肤进行组织学观察，评估MXD/SCD@TFs对AGA的疗效。 8. 以豚鼠为模型动物，局部应用生理盐水作为对照，观察连续 7 天涂抹MXD/SCD@TFs 制剂后，豚鼠皮肤是否有刺激性及组织病理学变化，初步考察MXD/SCD@TFs的安全性。 结果： 1. 利用分子对接确定适合 MXD 的 CD 为磺丁基-β-环糊精（SBE-β-CD），其Eob在 12 种备选 CD 达到最小，为-9.74 Kcal/mol。PyMOL 可视化研究显示 MXD与SBE-β-CD通过三个氢键相互作用且能够完全进入SBE-β-CD的空腔中，其余CD只能将 MXD分子部分包合或将其完全暴露在腔体外。动力学模拟显示 MXD和 SBE-β-CD 复合物的位置均方根偏差很小，证实包合物结构是稳定的。相溶解度图实验表明 MXD分别与 SBE-β-CD、HP-β-CD以化学计量比 1∶1形成包合物，而 SBE-β-CD包合平衡常数为 666 M-1远大于 HP-β-CD的 131 M-1，进一步证明 SBE-β-CD是适合MXD的CD，与分子对接预测的结果一致。 2. 冷冻干燥法制备的 MXD 环糊精包合物外观为白色，在水中可以完全复溶。MXD和 SBE-β-CD的 1∶1混合物中 MXD的质量百分比为 9.09%，与高效液相色谱法测得的 MXD 在包合物中的含量（8.93 ± 0.55）%非常接近，表明 MXD 被很好地包合在 SBE-β-CD的亲脂腔中。包合物的 DSC图未见 MXD的特征峰，FT-IR图显示 MXD中的 N-O和 C=C的吸收峰显著减弱，SEM图表明包合物的表面形貌不同于MXD的条状结构和SBE-β-CD的球状结构，上述结果证实包合物已成功制备。 3. 通过单因素法优化得到 MXD 包合物传递体的最优处方是磷脂、胆固醇、Tween 80、MXD的质量比为 10∶3∶2.5∶6。MXD/SCD@TFs和 MXD@TFs均是淡黄色半透明溶液，粒径小于 100 nm，PDI 小于 0.2，Zeta 电位的绝对值超过 36 mV，pH接近中性。TEM 下均呈粒径均一的类球形囊泡形状，无明显聚集。两者的 EE 分别为（95.38 ± 0.22）%和（95.75 ± 0.30）%，无显著性差异，但 MXD/SCD@TFs 的DL为（44.02 ± 0.16）%，是 MXD@TFs（14.73 ± 0.15）%的近三倍。 4. MXD/SCD@TFs 和 MXD@TFs 离心后未见分层或者沉淀产生，表明其物理稳定性良好。在（4 ± 1）℃存储 28 天后，两种制剂的粒径、PDI、Zeta 电位和 EE均没有显著变化，表明两种传递体制剂在（4 ± 1）℃下至少可以稳定保存 28天。而在（25 ± 1）℃存储 28天后，两者的外观逐渐从浅黄色变深，粒径和 PDI无显著变化，Zeta 电位、EE 和 DL 均有所降低，但 MXD/SCD@TFs 的 EE 和 DL 仍高于MXD@TFs。在存储的第七天，MXD@TFs 的容器底部出现了明显的药物泄漏，而在整个观察期间 MXD/SCD@TFs 未发现药物析出，表明 MXD/SCD@TFs 与MXD@TFs相比不仅载药量高且有更好的稳定性。 5. MXD/SCD@Lip和 MXD@Lip的变形性指数分别为 8.01 ± 0.46和 8.36 ± 0.51，而MXD/SCD@TFs和 MXD@TFs的变形性指数分别为 10.82 ± 0.52和 13.36 ± 0.48，表明CD的加入降低了传递体的变形性，但仍显著优于脂质体的变形性。 6. 经皮渗透实验结果显示，MXD/SCD@TFs-2 在 24 h 的 DR 和 Jss 略低于MXD@TFs ，与此同时， MXD/SCD@TFs 的 Jss 及 DR 显著高于 MXD@TFs 和MXD/SCD@TFs-2，表明 CD的存在会延缓药物释放的速度，增加 DL是提高 Jss和DR的有效策略。 7. 连续 21天在 C57BL/6小鼠背部局部涂抹 2%睾酮溶液（1 mL/cm2），成功建立了 AGA模型。局部涂抹 MT、MXD@TFs和 MXD/SCD@TFs后，都能够缩短休止期和延长生长期从而延长 AGA小鼠的毛发生长周期。三种治疗组的促 AGA小鼠毛发生长效果为 MXD/SCD@TFs ＞ MXD@TFs ＞ MT。此外，皮肤组织病理学切片结果显示，模型组毛囊出现明显的微型化，毛囊的数量和长度显著低于生理盐水组。与模型组相比，三个治疗组均使毛囊长度显著增加，MXD/SCD@TFs 的促毛发生长能力优于 MT和 MXD@TFs。综上结果，说明 MXD以包合物形式载入传递体，在提高载药量的同时能够显著提高制剂对AGA的治疗效果。 8. MXD/SCD@TFs 在豚鼠背部皮肤多次给药后未观察到刺激作用，表明该制剂可在皮肤上安全使用。 结论： 本研究通过计算机模拟和相溶解度实验成功筛选出 SBE-β-CD是 β-CD及其 11个衍生物中最适合 MXD的 CD。确证 MXD和 SBE-β-CD以化学计量比 1∶1形成包合物，具有最低的 Eob 和稳定的结构。单因素法筛选的最优包合物传递体MXD/SCD@TFs 中磷脂、胆固醇、Tween 80 和 MXD 的质量比为 10∶3∶2.5∶6。MXD/SCD@TFs 和相应的传递体 MXD@TFs 粒径均小于 100 nm 且分布均匀，呈类球形，两者EE可达到90%以上，而MXD/SCD@TFs的DL相较于MXD@TFs提高了三倍，且表现出更好的稳定性和经皮渗透活性。此外，MXD/SCD@TFs 对豚鼠皮肤无刺激，对 AGA 的治疗效果显著优于市售酊剂和 MXD@TFs。由此，筛选适合的CD包合MXD，以包合物的形式载入传递体中，充分发挥了“药物-CD-传递体”的优势，而增加传递体的DL是提高MXD对AGA疗效的一种有前景的策略。
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