摘要
【目的】本试验将从富硒酵母中提取硒代蛋氨酸（SeMet），制备硒代蛋氨酸纳米粒（CS-SeMet），通过建立氟暴露小鼠模型，综合比较SeMet与CS-SeMet对氟致脾脏损伤的干预效果，并探究TLR4/NF-κB通路在CS-SeMet缓解氟诱导的小鼠脾脏炎性损伤中的作用。 【方法】选取酿酒酵母，通过在培养基中加入亚硒酸（H2SeO3）溶液，得到富硒酵母，再经过胰蛋白酶裂解得到SeMet，将裂解的SeMet过滤后与壳聚糖（CS）、三聚磷酸钠（TPP）通过交联法制备CS-SeMet。利用紫外吸收光谱仪、傅里叶红外光谱仪、扫描电镜、粒径和电位分析仪表征CS-SeMet。体外DPPH、ABTS自由基清除试验检测CS-SeMet的抗氧化活性。通过ICP-MS仪对CS-SeMet进行包封率和模拟体外释放的检测。选取雄性C57BL/6 小鼠 90 只，平均分为 C 组（蒸馏水）、F 组（150 mg/L NaF）、SeMet组（0.5 mg/kg·bw，标准 SeMet）、CS-SeMet 组（含 0.5 mg/kg·bw SeMet 的 CS-SeMet）、F+SeMet 组（150 mg/L NaF+0.5 mg/kg·bw 标准 SeMet）、F+CS-SeMet 组（150 mg/L NaF+含 0.5 mg/kg·bw SeMet 的 CS-SeMet）。饲养15 周后，采取小鼠血液并取小鼠脾脏组织， HE染色观察小鼠脾脏组织病理学变化，透射电镜观察小鼠脾脏组织中脾细胞超微结构。血液细胞分析仪检测血常规，生化试剂盒检测脾脏组织中氧化应激相关指标的含量， ELISA检测小鼠脾脏组织的抗体水平和GPX4以及小鼠血清中SEP的含量。应用qRT-PCR 和Western Blot 技术检测 TLR4/NF-κB 信号通路相关因子的基因蛋白水平，免疫荧光染色统计IL-6、IL-1β、TNF-α的表达情况。 【结果】1.制备出平均粒径为 145.7±0.46 nm，均一的、呈淡蓝色的 CS-SeMet。CS-SeMet的包封率可以达到67.76%，且具有良好的体外抗氧化功能和缓释效果。 2.组织病理学观察发现 C 组小鼠脾脏组织白髓、红髓分界明显，细胞排列规则；F组脾脏组织红白髓分界不清淅，分布紊乱，且白髓区域面积不同程度减少。补充SeMet和CS-SeMet后，小鼠脾脏组织红髓和白髓分界明显，细胞排列规则，较F组相比有明显恢复。对照脾脏组织的超微结构显示，C组脾脏电镜显示脾索外观正常，F组电镜显示具有大量变性和核固缩的淋巴细胞，且观察到线粒体也发生破坏、溶解、破裂，而在加入SeMet和CS-SeMet后，这些现象有所缓解。 3.血常规检测发现，与C组相比，F组小鼠血液中粒细胞比率和白细胞总数显著升高（##P＜0.01），血红蛋白含量和红细胞总数显著降低（#P ＜ 0.05）。与 F 组相比，F+CS-SeMet 组的白细胞总数显著降低（**P ＜ 0.01），红细胞总数和血红蛋白含量显著升高（*P ＜ 0.05），F+SeMet 组的白细胞总数显著降低（*P ＜ 0.05），血红蛋白浓度显著升高（*P ＜ 0.05）。 4.氧化应激结果显示，与C组相比，F组小鼠脾脏组织的MDA和ROS含量显著升高（#P ＜ 0.05），SOD 和 CAT 含量显著降低（##P ＜ 0.01）。与 F 组相比，F+CS-SeMet和 F+SeMet 组的 SOD 和 CAT 含量均显著升高（**P ＜ 0.01），MDA含量均显著降低（*P ＜ 0.05），且 F+CS-SeMet 组的 ROS 水平也有显著降低（*P ＜ 0.05）。 5.通过ELISA检测结果显示，与C组相比，F组小鼠脾脏组织的IgA、IgG和IgM抗体水平和硒蛋白 GPX4、SEP 表达水平均显著降低（##P ＜ 0.01）；与F 组相比，F+CS-SeMet 组小鼠脾脏组织的 IgA、IgG和 IgM 抗体水平极显著升高（***P ＜ 0.001），硒蛋白 GPX4 和 SEP 表达水平显著升高（**P ＜ 0.01），F+SeMet 组对小鼠脾脏组织的抗体水平和GPX4以及SEP也均有显著升高。 6.通过 qRT-PCR 检测发现，与 C 组相比，F 组小鼠脾脏组织的 TLR4、TRAF6、MyD88、P65、IKKβ、IκBα、IL-6、IL-1β、TNF-α 的 mRNA 表达水平显著升高（##P ＜ 0.01），TGF-β 和 IL-10 的 mRNA表达水平显著降低（##P ＜ 0.01）。与 F组相比，F+CS-SeMet 组 TLR4/NF-κB 通路基因表达水平均显著降低（*P ＜ 0.05），TGF-β 和 IL-10 的mRNA表达水平显著升高（*P ＜ 0.05）；F+SeMet 组 TRAF6、MyD88、P65、IκBα、IL-1β、TNF-α 的 mRNA表达水平显著降低（*P ＜ 0.05），IL-10 的 mRNA 表达水平极显著升高（***P ＜ 0.001）。 7.蛋白表达水平结果显示，与C组相比，F组TLR4、IKKβ、P-P65、P65的蛋白表达水平显著升高（#P ＜ 0.05），而 IκBα的蛋白表达水平显著降低（##P ＜ 0.01）。与 F 组相比，F+CS-SeMet 组 TLR4、IKKβ、P-P65、P65 的蛋白表达水平均显著降低（*P ＜ 0.05）， IκBα的蛋白表达水平显著升高（*P ＜ 0.05），F+SeMet 组 TLR4 和 IKKβ 的蛋白表达水平均显著降低（**P ＜ 0.01）。 【结论】1．本实验成功制备出具有抗氧化活性的CS-SeMet，可有效补充脾脏硒含量。 2．150 mg/L NaF暴露 15 周后，导致了小鼠脾脏组织的氧化应激，促进炎性因子的分泌，诱发炎症，损害了脾脏的组织结构，导致其免疫功能下降。 3．CS-SeMet（含 0.5 mg/kg·bw 的 SeMet）可有效地通过影响 TLR4/NF-κB 通路的基因蛋白表达，抑制炎性因子的分泌，缓解脾脏组织氧化应激，从而改善小鼠脾脏组织的炎性损伤以及恢复脾脏组织的免疫功能。
NETL