摘要
目的 本研究旨在检测锌离子对脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）后小胶质细胞与神经元之间线粒体转移的调控作用，探究锌通过SIRT3/Mfn2依赖性调控线粒体转移，修复脊髓损伤的作用机制。 方法 1、动物实验：130只健康雌性C57BL/6J小鼠（8周龄）随机分为4组：假手术组（Sham）、脊髓损伤组（SCI）、脊髓损伤+锌治疗组（Zinc）、脊髓损伤+锌+三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺组（3-TYP），3-TYP为SIRT3蛋白的抑制剂。SCI组术后两小时腹腔注射等渗葡萄糖（30mg/kg），连续注射3天，每天注射一次。Zinc组术后两小时腹腔注射葡萄糖酸锌（30mg/kg），连续注射3天，每天注射一次。3-TYP组在术前一周腹腔注射3-TYP（50mg/kg），隔日一次，术后治疗与Zinc组相同。采用足迹实验、BMS评分和斜板实验检测小鼠的运动功能恢复情况；采用HE染色、Nissl染色观察SCI后28天的小鼠脊髓内组织损伤的情况；应用免疫荧光染色检测SCI后3天小鼠神经元内TOMM20、Nrf2、Cleaved Caspase3与小胶质细胞内Mfn2蛋白的表达水平；应用试剂盒检测SCI后3天小鼠ATP、MDA和SOD含量及GSH-PX活性；应用RT-qPCR技术检测SCI后3天小鼠SIRT3、Mfn2 mRNA含量；应用免疫印迹技术检测SCI后3天小鼠SIRT3、Mfn2蛋白含量。 2、细胞实验：体外培养PC12细胞和BV2细胞，采用过氧化氢（H2O2）诱导PC12细胞构建体外氧化应激模型，将BV2细胞与受损 PC12细胞共培养，实验分为以下几组：对照组（Control）、过氧化氢组（H2O2）、过氧化氢+锌组（Zinc）、过氧化氢+锌+si-Mfn2组（si-Mfn2）、过氧化氢+锌+3-TYP组（3-TYP）。其中，H₂O₂浓度为60μmol/L，处理细胞2小时。Zinc组中葡萄糖酸锌的浓度为90μmol/L，处理细胞2小时。3-TYP组中浓度为50μmol/L，3-TYP在H₂O₂处理前三小时使用。应用共聚焦显微镜观察Mito-tracker表达，验证BV2细胞向PC12细胞转移线粒体情况；应用ATP、MDA、SOD、GSH-PX试剂盒检测相应含量变化；采用免疫荧光染色检测Mfn2、SIRT3、Nrf2、Cleaved Caspase3蛋白的表达情况；应用流式细胞术检测细胞凋亡和ROS情况；应用JC-1探针检测PC12细胞的线粒体功能。 结果 1、动物实验结果：①足迹实验、BMS评分和斜板实验结果显示SCI组后肢运动功能受损十分严重，Zinc治疗组运动功能有一定程度改善。②HE染色、Nissl染色提示与SCI组相比，Zinc组脊髓组织内组织损伤减轻，神经元数量增多。③免疫荧光染色结果提示与SCI组比较，Zinc组TOMM20、Nrf2、Mfn2蛋白表达增加，Cleaved Caspase3蛋白表达减少，而与Zinc组比较，3-TYP组Mfn2蛋白表达减少，Cleaved Caspase3的表达增加。④ATP和氧化应激试剂盒结果显示SCI组ATP、SOD含量和GSH-PX活性减少，MDA含量增加，Zinc组ATP、SOD含量和GSH-PX活性增加，MDA含量减少。⑤RT-qPCR结果显示与SCI组相比， Zinc组SIRT3和Mfn2 mRNA含量增加，与Zinc组相比，3-TYP组SIRT3和Mfn2 mRNA含量降低。⑥蛋白免疫印迹结果证实SCI后，SIRT3和Mfn2蛋白含量减少，而Zinc治疗能够增加SIRT3和Mfn2蛋白含量，3-TYP组SIRT3和Mfn2蛋白含量降低。 2、细胞实验结果：①BV2细胞PC12细胞共培养后，Mito-tracker染色结果提示，与H2O2组比较，Zinc组BV2细胞Mito-tracker标记的线粒体转移到PC12细胞的数量更多，与Zinc组比较，si-Mfn2组线粒体转移数量减少。②ATP和氧化应激试剂盒结果显示H2O2组ATP、SOD含量和GSH活性减少，MDA含量增加，Zinc组ATP、SOD含量和GSH活性增加，MDA含量减少。③免疫荧光染色结果显示：与H2O2组相比，Zinc治疗组Nrf2、SIRT3和Mfn2蛋白表达增加，Cleaved Caspase3蛋白表达减少，与Zinc组相比，si-Mfn2组Nrf2和Mfn2蛋白表达减少， Cleaved Caspase3蛋白表达增加，3-TYP组SIRT3和Mfn2蛋白表达减少。④流式细胞术检测细胞凋亡结果提示，与H2O2组比较，Zinc组细胞凋亡减少；流式细胞术检测细胞ROS水平结果提示，Zinc组ROS水平低于H2O2组，而si-Mfn2组ROS水平高于Zinc组。⑤JC-1染色结果显示Zinc组Red/Green比值高于H2O2组， si-Mfn2组Red/Green比值低于Zinc组。 结论 本研究证实锌通过SIRT3/Mfn2依赖性调节SCI后小胶质细胞内的线粒体向神经元转移，恢复线粒体功能，缓解氧化应激，抑制神经元凋亡，从而促进SCI后小鼠运动功能的恢复。
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