摘要
心肌梗死是全球普遍的心血管疾病，可引起心力衰竭。心肌梗死患者心衰的严重程度与死亡率密切相关。因此，心肌梗死后心衰的持续发生仍然是临床实践中的一个重要问题。目前，经皮冠状动脉介入治疗是心肌梗死最常用的治疗方法。有效清除阻塞血管，恢复血流，挽救心肌组织。然而，即使应用积极的PCI，仍有10%-20%的心肌梗死患者在出院后1年内发生心肌梗死后心衰。因此，对于心梗后心衰的治疗及研究具有重要的意义。 心肌梗死后微循环障碍、侧支循环不良和异常交感神经兴奋是导致心室重构、不良心血管事件的重要因素。心肌梗死瘀血阻络的病机本质在于血液循环障碍，不仅表现为冠状动脉狭窄导致的心肌缺血，也主要表现在微循环的改变。研究发现，冠心病血瘀证患者存在微血管闭塞、管袢畸形、血流缓慢、血细胞聚积、血粘度增加、红细胞变形能力下降等微循环障碍表现。中医认为，肾为先天之本而藏精，主人体的生长和发育，如“心之合脉也，其荣色也，其主肾也”。因此，补肾是血管新生的基础，补肾填精，则血足脉生。中医认为，心藏神的功能和心主血脉的功能是统一的，如“心者，五脏六腑之大主也，精神之所舍也，其脏坚固，邪弗能容也。容之则心伤，心伤则神去。”因此，血瘀的病理因素可直接影响心神，这与交感神经兴奋有密切关系。此外，研究表明交感神经在兴奋状态下影响冠脉血流，从而对心脏产生影响，也属于中医“瘀血扰神”的范畴。因此，我们认为心梗后心衰与中医血瘀、肾虚、神扰的证候密切相关。 有研究表明，线粒体结构异常和功能障碍，导致的心脏能量代谢的异常，在心肌梗死后心功能不全和心室重塑的发病机制中至关重要。因此，以能量代谢为药理学治疗靶点的治疗方法，已经成为了改善衰竭心脏功能的一种非常有潜力的新型治疗方法，具有重要的临床意义。 活血补肾安神方是导师王阶教授结合多年临床实践与名老中医经验总结出的有效方剂，药物组成有丹参、三七、赤芍、红花、肉苁蓉、巴戟天、茯苓、酸枣仁等，可补肾活血、益气安神、利水通经，善治心梗后心衰肾虚血瘀证。本团队前期通过系列基础和临床研究发现，活血补肾安神方能在炎症反应、心肌纤维化、微循环、侧支循环等方面发挥保护作用，对心脏能量代谢具有改善作用。因此，明确活血补肾安神方治疗心梗后心衰的作用机制，是临床亟待解决的关键问题。 本课题来源于国家自然科学基金《急性心肌梗死后心室重构的中医证候特征及活血化瘀法干预的机制研究》（82230124）。文章通过检索 GEO 数据库的心梗后心衰芯片表达谱数据集，筛选出关键靶点。并通过心梗后心衰患者的血样进行验证。构建 H9c2 心肌细胞氧化应激模型模拟心肌损伤，观察活血补肾安神方对心肌细胞能量代谢的改善作用，并运用细胞转染构建细胞过表达模型，探究活血补肾安神方通过关键基因及通路，减少细胞凋亡，改善心肌损伤的作用机制。为临床治疗心梗后心衰等疾病提供一定的实验依据。 目的 本文章包括三个部分，目的为探讨活血补肾安神方对心肌细胞能量代谢的改善作用，及减轻心肌损伤的作用机制。具体为： 1. 检索 GEO 数据库的心梗后心衰芯片表达谱数据集，筛选关键基因和信号通路。 2. 选用中国中医科学院广安门医院心梗后心衰患者的血样对筛选出的关键基因和信号通路进行验证。 3. 观察活血补肾安神方对 H9c2 心肌细胞损伤的改善作用。通过 ATP 酶活性检测及seahorse XFe 24 检测实时 ATP 生成速率、线粒体压力、糖酵解速率和长链脂肪酸氧化压力，探究活血补肾安神方对心肌细胞能量代谢的改善作用，并运用细胞转染构建细胞过表达模型，阐明活血补肾安神方通过相应基因及通路，减少细胞凋亡，减轻心肌损伤的作用机制。 方法 1. 以GEO 数据库的心梗后心衰芯片表达谱数据为研究基础，检索得到数据集。并进行背景校正、归一化和计算表达值，最终得到表达矩阵数据。对数据集进行基因差异分析，鉴定出心梗后心衰患者差异表达基因。用差异表达基因构建蛋白质相互作用网络，对其进行Logistic回归分析与ROC曲线分析、GO和KEGG富集分析。根据分析结果，选取关键基因、通路进行进一步验证及探索。 2. 以中国中医科学院广安门医院为临床试验单位，纳入 60 例心梗后心衰患者及 20例无心血管疾病志愿者。qRT-PCR 检测mRNA表达水平，验证关键基因和信号通路分子。 3. 细胞实验 3.1 用 H2O2 干预H9c2 心肌细胞建立氧化应激心肌损伤模型，采用 CCK-8 法筛选药物最大无毒浓度。对活血补肾安神方及方内各药组干预后的心肌细胞，进行Na+k+-ATP酶活性检测。 3.2 对活血补肾安神方及方内药组干预后的心肌细胞，采用 Seahorse XFe 24 仪器进行实时 ATP 生成速率、线粒体压力、糖酵解速率和长链脂肪酸氧化压力测定，观察心肌细胞能量代谢变化。 3.3 通过细胞转染 JDP2 过表达关键基因。流式细胞仪检测各组细胞凋亡，观察各组细胞上清MDA、SOD、NADPH水平，WB检测AhR、JDP2、Nrf2、HO-1蛋白含量， qRT-PCR检测AhR、JDP2、Nrf2、HO-1相对表达量。 结果 1. 对 GEO 数据库的心梗后心衰芯片表达谱数据数据集进行处理分析，发现： （1）筛选到了3个hub基因，分别是JDP2、FMN1、RNASE1。 （2）GO功能富集分析显示，差异基因主要参与的生物过程（BP）包括：细胞氮化合物代谢过程、压力反应、生物合成、离子结合、细胞蛋白质修饰过程等。差异基因主要参与的分子功能（MF）包括：蛋白结合转录因子活性、核酸结合转录因子活性、细胞骨架蛋白结合、蛋白质复合物、酶结合、RNA 结合等。差异基因主要参与的细胞成分（CC）包括：线粒体、细胞器、胞质溶胶、核质等。KEGG富集分析显示主要富集的通路有：流体剪切应力与动脉粥样硬化、疟疾、代谢途径、补体和凝血级联、B细胞受体信号通路、类风湿性关节炎、IL-17信号通路等。 （3）JDP2是心梗后心衰能量代谢相关的可能的关键基因，AhR-JDP2-Nrf2信号轴是心梗后心衰能量代谢相关的可能的关键信号轴。 2. 选用中国中医科学院广安门医院心梗后心衰患者的血样对筛选出的关键基因和信号通路进行验证，发现 AhR-JDP2-Nrf2 信号轴分子在心梗后心衰患者中存在表达差异。 3. 细胞实验 3.1 观察活血补肾安神方及方内药组对 H9c2 心肌细胞能量代谢的影响，发现： （1）H2O2最佳造模浓度为 800 μM/L，最佳造模时间为 4 h。 （2）活血补肾安神方最大无毒浓度为 5 mg/ml，补肾药组最大无毒浓度为 4 mg/ml，补气药组最大无毒浓度为 3 mg/ml，安神药组最大无毒浓度为 7 mg/ml，利水药组最大无毒浓度为 7 mg/ml，活血药组最大无毒浓度为 1.2 mg/ml，通经药组最大无毒浓度为 2 mg/ml，盐酸曲美他嗪最大无毒浓度为浓度在 30 μg/ml。 （3）活血补肾安神方、及方内补肾药组（肉苁蓉等）、补气药组（黄芪等）对Na+k+-ATP 酶活性有显著改善作用（P ＜ 0.05）。 3.2 观察活血补肾安神方及补肾药组、补气药组对心肌细胞能量代谢的影响，发现： （1）模型组较正常组细胞 ATP 生成减少（P ＜ 0.01），曲美他嗪组、活血补肾安神方组、补肾组、补气组糖酵解 ATP 生成较模型组增加（P ＜ 0.01），曲美他嗪组、活血补肾安神方组、补肾组线粒体 ATP 生成较模型组增加（P ＜ 0.01）。 （2）模型组较正常组细胞基础氧耗、非线粒体氧耗、ATP 生成能力、细胞储备呼吸能力及最大呼吸能力减少（P ＜ 0.01）。活血补肾安神方组基础氧耗、非线粒体氧耗、ATP 生成能力、细胞储备呼吸能力及最大呼吸能力较模型组增加（P ＜ 0.05）。补气组基础氧耗、质子漏值、非线粒体氧耗、ATP 生成能力、细胞储备呼吸能力及最大呼吸能力较模型组增加（P ＜ 0.05）。 （3）结果显示，模型组较正常组细胞基础糖酵解减少（P ＜ 0.05），活血补肾安神方组、补肾组、补气组基础糖酵解较模型组增加（P ＜ 0.05）。 （4）模型组较正常组细胞长链脂肪酸基础呼吸、急性响应以及最大呼吸值减少（P ＜ 0.05），活血补肾安神方组长链脂肪酸基础呼吸、急性响应以及最大呼吸值较模型组增加（P ＜ 0.05）。补气组长链脂肪酸基础呼吸、最大呼吸值较模型组增加（P ＜ 0.05），急性响应较模型组降低（P ＜ 0.05）。 3.3 观察活血补肾安神方通过调控关键基因 JDP2 及 AhR-Nrf2通路表达，减少细胞凋亡、减轻心肌损伤的作用，发现： （1）肉苁蓉苯乙醇苷最大无毒浓度为 31.25 μg/ml，人参皂苷 Re 最大无毒浓度为7.8 μg/ml。 （2）H2O2诱导心肌细胞氧化应激可显著提升细胞的早期凋亡率（P ＜ 0.01）、晚期凋亡率（P ＜ 0.01）及总凋亡率（P ＜ 0.01）。活血补肾安神方、人参皂苷 RE、肉苁蓉苯乙醇苷、盐酸曲美他嗪干预后可降低细胞的早期凋亡率（P ＜ 0.01）、晚期凋亡率（P ＜ 0.01）及总凋亡率（P ＜ 0.01）。过表达 JDP2 可显著提升细胞的早期凋亡率（P ＜ 0.01）、晚期凋亡率（P ＜ 0.01）及总凋亡率（P ＜ 0.01）。活血补肾安神方、肉苁蓉苯乙醇苷、盐酸曲美他嗪干预后可降低过表达细胞的早期凋亡率（P ＜ 0.01）、晚期凋亡率（P ＜ 0.01）及总凋亡率（P ＜ 0.01）。人参皂苷RE干预后可降低过表达细胞的晚期凋亡率（P ＜ 0.05）。 （3）H2O2诱导心肌细胞氧化应激可提高细胞 MDA值（P ＜ 0.05），活血补肾安神方、人参皂苷RE、肉苁蓉苯乙醇苷、盐酸曲美他嗪干预后可降低细胞MDA值（P ＜ 0.05）。过表达 JDP2 可提高细胞的 MDA值（P ＜ 0.01），活血补肾安神方、人参皂苷 RE、盐酸曲美他嗪可降低过表达细胞的 MDA值（P ＜ 0.01）。 （4）过表达 JDP2 可降低细胞 SOD活性（P ＜ 0.01），活血补肾安神方、人参皂苷RE 可提高过表达细胞的 SOD活性（P ＜ 0.05）。 （5）H2O2诱导心肌细胞氧化应激可提高细胞 NADPH 值（P ＜ 0.05），活血补肾安神方、人参皂苷 RE、肉苁蓉苯乙醇苷、盐酸曲美他嗪干预后可降低细胞的 NADPH 值（P ＜ 0.05）。过表达 JDP2 可提高细胞 NADPH 值（P ＜ 0.01），活血补肾安神方、人参皂苷RE、肉苁蓉苯乙醇苷、盐酸曲美他嗪可降低过表达细胞的 NADPH 值（P ＜ 0.01）。 （6）H2O2诱导心肌细胞氧化应激可提高 AhR、JDP2、Nrf2、HO-1 蛋白表达（P ＜ 0.05），活血补肾安神方、盐酸曲美他嗪可降低 AhR、JDP2、Nrf2、HO-1 蛋白表达（P ＜ 0.05），人参皂苷 RE、肉苁蓉苯乙醇苷可降低 AhR、Nrf2、HO-1 蛋白表达（P ＜ 0.05）。过表达JDP2 可促进细胞 AhR、JDP2、Nrf2、HO-1 蛋白表达（P ＜ 0.05），活血补肾安神方、肉苁蓉苯乙醇苷、盐酸曲美他嗪可降低过表达细胞的AhR、JDP2、Nrf2、HO-1蛋白表达（P ＜ 0.05），人参皂苷 RE 可降低过表达细胞的 JDP2、Nrf2、HO-1 蛋白表达（P ＜ 0.05）。 （7）H2O2诱导心肌细胞氧化应激可提高AhR、JDP2、Nrf2、HO-1的mRNA相对表达量（P ＜ 0.05）。活血补肾安神方、盐酸曲美他嗪可降低 AhR、JDP2、Nrf2、HO-1 转录（P ＜ 0.05）。人参皂苷 RE 降低 AhR、HO-1 转录（P ＜ 0.05）。肉苁蓉苯乙醇苷降低AhR、Nrf2、HO-1 转录（P ＜ 0.05）。过表达 JDP2 可促进细胞 AhR、JDP2、Nrf2、HO-1 的转录（P ＜ 0.05）。活血补肾安神方、人参皂苷 RE、肉苁蓉苯乙醇苷、盐酸曲美他嗪可降低过表达细胞AhR、JDP2、Nrf2、HO-1 的转录（P ＜ 0.05）。 结论 JDP2基因及AhR-JDP2-Nrf2轴是心梗后心衰能量代谢相关的关键基因及信号通路。活血补肾安神方可通过调控JDP2基因表达和AhR-JDP2-Nrf2轴，降低H2O2诱导的H9c2细胞的凋亡率，降低AhR、JDP2、Nrf2、HO-1蛋白表达，减少MDA、NADPH生成，提高ATP生成速率，改善线粒体压力、糖酵解速率与长链脂肪酸氧化压力，发挥保护心肌细胞的作用。 方中补肾组、补气组药物可提高细胞Na+k+-ATP酶活性，改善细胞能量代谢。补肾药组对于心肌细胞能量代谢的改善主要表现在糖酵解过程。补气药组对于心肌细胞能量代谢的改善主要表现在线粒体过程，对糖酵解过程也有改善效果但不如补肾药组疗效明显，且对脂肪酸代谢也有改善作用。 其主要有效成分肉苁蓉苯乙醇苷、人参皂苷Re可通过调控AhR-JDP2-Nrf2轴，降低H2O2诱导的H9c2细胞的凋亡率，降低AhR-JDP2-Nrf2信号轴蛋白表达，减少MDA、NADPH生成，发挥保护心肌细胞的作用。
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