摘要
研究背景 肠易激综合征（Irritable Bowel Syndrome，IBS）在全球的患病率约3%~5%之间，临床表现以发作性的腹痛、排便习惯或性状的改变为特点，虽属于功能性胃肠疾病范畴，但可造成患者生活质量严重下降。在IBS的4个亚型中，腹泻型肠易激综合征（Irritable Bowel Syndrome with predominant Diarrhea，IBS-D）最为常见，为患者带来更多的困扰。 关于肠易激综合征的发病机制，目前的研究发现脑肠互动异常、肠黏膜屏障功能受损、肠道菌群失调、低度炎症及免疫异常激活、内脏高敏感等多种因素均发挥了重要的作用。肠黏膜屏障作为肠道菌群与宿主、炎症因子与肠神经系统、食物抗原与免疫细胞等交互作用共同的结构基础，其结构及功能的完整性对于维持肠道微环境的稳态十分重要。其中紧密连接蛋白所构成的机械屏障，直接决定着细胞膜的通透性，对屏障功能的调节起到了关键的作用。Occludin作为紧密连接蛋白家族分子之一，是细胞旁渗漏途径的主要调控分子，阻挡着大分子的透过，具有非选择性、低通量的特点，因此是阻挡食物抗原、有害菌群代谢产物等侵袭的重要环节。较多临床研究发现IBS-D患者肠上皮细胞Occludin表达下调，且不一定伴有转录水平的降低。既往研究表明，炎性肠病等炎症、免疫细胞异常活化相关疾病可通过促进窖蛋白Caveolin-1介导的Occludin内吞降解来增加黏膜通透性，使各种致病因子更易透过黏膜屏障，但Caveolin-1介导的Occludin内吞增加是否是IBS-D黏膜屏障受损的机制之一，尚待进一步研究。 疏肝健脾中药痛泻要方，及由该方化裁而来的经验方肠安Ⅱ号，已被证明对IBS-D具有较好的临床疗效，且可增加IBS-D肠上皮细胞Occludin等紧密连接蛋白的表达水平，从而修复肠黏膜屏障功能，而诱导细胞自噬是其发挥作用的可能途径之一。既往研究发现，疏肝健脾经典方痛泻要方对肠上皮细胞自噬具有促进作用；而自噬作为细胞对炎症等损伤的保护性反应，在炎性肠病等疾病发生时，可通过清除衰老损伤细胞器及错误折叠蛋白、减少细胞凋亡、减少Occludin为主的紧密连接蛋白内吞等方式，改善肠黏膜屏障功能；ERK1/2通路既与细胞自噬相关，又参加蛋白内吞的调控，可能为二者之间的交叉通路。然而，肠安Ⅱ号方是否通过诱导自噬、减少Occludin内吞发挥对肠黏膜屏障的修复作用，该作用是否依赖ERK1/2通路，均有待实验验证。 因此，本研究以肠上皮细胞自噬调控紧密连接蛋白Occludin 内吞为切入点，探索IBS-D 肠黏膜屏障功能受损的分子机制，并进一步阐释肠安Ⅱ号方的疗效机制，以期为疏肝健脾中药复方治疗 IBS-D 提供科学依据。 第一部分 临床研究 研究目的 基于肠上皮细胞自噬及紧密连接蛋白Occludin内吞研究IBS-D患者肠黏膜屏障功能受损的机制。 研究方法 收集IBS-D患者及健康志愿者降结肠黏膜样本各6例，通过HE染色反映结肠黏膜的结构变化，通过免疫组化染色反映Occludin、自噬相关蛋白p62的表达及分布情况，通过Occludin与内吞关键蛋白Caveolin-1免疫荧光共定位反映Occludin内吞水平，通过LC3免疫荧光染色及其荧光斑点计数反映自噬水平，通过RT-qPCR检测Occludin、Caveolin-1、p62及ERK1/2的mRNA水平。 研究结果 健康人与IBS-D患者在性别、年龄、民族等一般情况方面构成比差异无统计学意义（P＞0.05）。降结肠黏膜HE染色显示：与健康人结肠黏膜结构相比，IBS-D患者结肠黏膜结构完整性相对欠佳，可见部分腺体增生，黏膜下层血管扩张及炎性细胞浸润等。免疫组化显示，与健康志愿者相比，IBS-D患者紧密连接蛋白Occludin平均光密度值明显减弱，自噬相关蛋白p62平均光密度值明显增强，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。免疫荧光显示，与健康志愿者相比，IBS-D患者Occludin、Caveolin-1蛋白的共定位明显增强；LC3以弥漫分布为主，斑点状分布较健康人减少，平均LC3斑点数较健康人显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。RT-qPCR结果显示，与健康志愿者相比， IBS-D患者Occludin、Caveolin-1转录水平无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；IBS-D患者自噬相关蛋白p62转录水平较健康人明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；IBS-D患者ERK转录水平较健康人有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 研究结论 1. IBS-D患者存在轻微的结肠黏膜病理改变，反映了低度炎症的存在。 2. IBS-D患者结肠黏膜紧密连接蛋白Occludin表达明显下调，且Occludin水平的下降与转录水平无关。 3. IBS-D患者结肠上皮细胞存在Occludin内吞增加的现象，该现象与Caveolin-1转录水平无关。 4. IBS-D患者结肠上皮细胞自噬水平较健康人显著下降，可能为Occludin内吞增加的机制之一。 第二部分 在体实验研究 研究目的 研究肠安Ⅱ号方对肝郁脾虚型IBS-D大鼠的疗效，并从自噬抑制Caveolin-1介导的Occludin内吞的角度揭示干预机制。 研究方法 IBS-D肝郁脾虚大鼠模型的建立采用三种处理方式叠加干预，依次为新生母子分离（2周）、4%乙酸灌肠（1次）和束缚应激（2周）。模型评价通过观察大鼠毛色、精神状态、活动性等反应一般状况，粪便含水量、腹壁回撤反射实验（Abdominal Withdrawal Reflex，AWR）分别反映内脏高敏感及腹泻情况，通过测定体重、抓力、进食量反映脾虚证候情况，通过糖水偏嗜实验反映肝郁证候情况。成模后，以肠安Ⅱ号方低、中、高剂量灌胃或自噬诱导剂雷帕霉素隔日腹腔注射干预IBS-D模型大鼠14天，并通过粪便含水量、AWR评分评价肠安Ⅱ号方及雷帕霉素的疗效。 取大鼠降结肠组织进行免疫荧光染色，观察Occludin与Caveolin-1共定位情况反映Occludin内吞水平，LC3与p62共定位反映自噬水平；透射电镜观察大鼠结肠上皮细胞间紧密连接结构、微绒毛的排列及自噬小体、自噬溶酶体的分布情况；Western blot测定大鼠结肠组织中Occludin、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、ERK1/2、p-ERK1/2的表达水平。 研究结果 三因素造模后观察模型组一般状况发现，与正常组大鼠相比，模型组毛色光泽度与正常组大鼠相比明显较差，且质地欠润、更易脱落，精神萎靡不振、不喜活动；大便质地常呈糊状甚至水样，污染肛周毛发且有明显异味。在疾病评价指标方面，IBS-D模型组大鼠粪便含水在新生母子分离后与正常组相比差异不具有统计学意义（P＞0.05），在乙酸灌肠后、束缚应激后均较正常组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与正常组相比，IBS-D 模型大鼠在各造模阶段、各结肠扩张容积下的AWR评分均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；从脾虚证候指标来看，IBS-D 模型大鼠体重在乙酸灌肠、束缚应激后明显低于正常组，进食量在束缚应激后明显低于正常组，抓力在乙酸灌肠、束缚应激后明显低于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；从肝郁证候指标来看，IBS-D 模型大鼠在束缚应激后糖水偏嗜率明显低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）。在肠安Ⅱ号方或自噬诱导剂雷帕霉素干预14天后，肠安Ⅱ号方各剂量组及雷帕霉素组的粪便含水量均较模型组下降，其中肠安Ⅱ号方中剂量组、雷帕霉素组与模型组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；肠安Ⅱ号方各剂量组及雷帕霉素组各结肠扩张容积下的AWR评分均明显低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 大鼠结肠组织免疫荧光结果显示，与正常组相比， IBS-D 模型组 Occludin 与Caveolin-1共定位明显增加，p62与LC3共定位明显减少；与模型组相比，肠安Ⅱ号方低、中、高剂量组、雷帕霉素组Occludin与Caveolin-1共定位明显减少，p62与LC3共定位明显增加。透射电镜显示，与正常组相比，模型组大鼠结肠上皮细胞表面微绒毛排列紊乱，紧密连接结构完整性较差，细胞间隙增宽，自噬小体、自噬溶酶体数量减少；与模型组相比，肠安Ⅱ号方各剂量组、雷帕霉素组大鼠结肠上皮细胞表面微绒毛排列更为规整，紧密连接结构完整，细胞排列紧密，自噬小体、自噬溶酶体明显增多。 Western blot结果显示，与正常组相比，模型组Occludin蛋白表达显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，肠安Ⅱ号方低、中、高剂量组及雷帕霉素组Occludin的表达均上调，其中雷帕霉素组、肠安Ⅱ号中剂量组差异具有统计学意义（P＜0.05）。与正常组相比，模型组大鼠结肠组织中LC3Ⅱ/Ⅰ无明显变化，差异不具有统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，雷帕霉素组及肠安Ⅱ号方低、中、高剂量组大鼠结肠组织中LC3Ⅱ/Ⅰ均上调，其中雷帕霉素组、肠安Ⅱ号方中剂量组与模型组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。模型组与正常组相比，p62表达差异不具有统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，雷帕霉素组、肠安Ⅱ号方低、中、高剂量组p62表达均有下调趋势，但差异均不具有统计学意义（P＞0.05）。与正常组相比，模型组p-ERK/ERK有下调趋势，差异不具有统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，雷帕霉素组、肠安Ⅱ号方低中、高剂量组p-ERK/ERK均上调，其中雷帕霉素组、肠安Ⅱ号方中剂量组与模型组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。 研究结论 1.建立大鼠IBS-D肝郁脾虚证模型时，依次采用新生母子分离、乙酸灌肠、束缚应激三种刺激因素作用叠加，可较好模拟IBS-D内脏高敏感、腹泻症状以及中医证候特征，是研究疏肝健脾中药干预IBS-D疗效机制的较好模型。 2.肠安Ⅱ号方可改善肝郁脾虚型IBS-D大鼠的一般状态，并改善AWR评分、粪便含水量等IBS疾病指标。 3.IBS-D模型组大鼠与正常组相比Occludin内吞增加、表达下调，自噬水平有所降低，ERK1/2通路一定程度上受到抑制。 4.肠安Ⅱ号方可诱导IBS-D大鼠结肠上皮细胞自噬水平升高，并减少了紧密连接蛋白Occludin的内吞，使Occludin水平上调，该作用可被自噬诱导剂雷帕霉素模拟，其机制可能与ERK1/2通路的激活有关。 第三部分 离体实验研究 研究目的 探讨肠安Ⅱ号方对肠上皮细胞Occludin蛋白内吞的干预机制。 研究方法 将Caco-2细胞接种于Transwell板培养21天后形成肠上皮细胞单层屏障功能模型。采用最佳浓度40 ng/mL TNF-α诱导Caco-2细胞Occludin内吞增加、机械屏障损伤；应用最佳浓度15%肠安Ⅱ号方含药血清培养基干预屏障损伤细胞，分别与阳性药物自噬诱导剂雷帕霉素、阴性药物自噬抑制剂3-MA进行对照，应用细胞电阻仪测量TEER，酶标仪检测并计算FITC-dextran跨膜表观渗透系数Papp，观察肠安Ⅱ号方含药血清对肠上皮细胞完整性、通透性的影响。 将Caco-2细胞接种于96孔板48 h后，将pCMV-mCherry-GFP-LC3B质粒应用Lipo 3000转染试剂转染进入Caco-2细胞建立LC3双荧光标记模型，用最佳浓度15%肠安Ⅱ号方含药血清培养基干预转染成功后的细胞，与阳性对照药物雷帕霉素及加用自噬早期抑制剂3-MA、自噬晚期抑制剂Bafilomycin的组别进行对照，观察不同干预下GFP、mCherry荧光标记的LC3荧光分布情况以研究肠安Ⅱ号方含药血清对Caco-2细胞自噬的调控作用。 将Caco-2细胞接种于10 cm培养皿培养48 h后，分别以40 ng/ml TNF-α诱导Caco-2细胞Occludin内吞，分别以500 nmol/L Rapamycin、15%肠安Ⅱ号含药血清干预，并分别研究自噬早期抑制剂5 mmol/L 3-MA、ERK1/2抑制剂20μmol/L PD98059对肠安Ⅱ号血清作用的影响，应用免疫共沉淀法研究不同处理条件下Occludin与Caveolin-1相互作用的情况，以研究肠安Ⅱ号方诱导的Caco-2细胞自噬对Occludin内吞的影响。 研究结果 15%中药含药血清干预组、阳性药雷帕霉素TEER均明显高于TNF-α诱导的屏障损伤模型，FITC-dextran渗透率则均明显低于模型组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；15%中药含药血清在3-MA干预的情况下，对屏障损伤模型TEER、FITC-dextran渗透率的改善作用被阻断，与15%中药含药血清组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。 荧光自噬示踪结果显示肠安Ⅱ号含药血清可诱导Caco-2细胞自噬，使自噬小体、自噬溶酶体荧光斑点数量增加，且该作用可被3-MA、Bafilomycin等自噬过程中不同阶段的抑制剂所阻断。与空白血清组相比，TNF-α模型组Caveolin-1条带相对灰度值明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与TNF-α模型组相比，雷帕霉素、肠安Ⅱ号含药血清干预组Occludin免疫共沉淀Caveolin-1条带相对灰度值明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；在肠安Ⅱ号含药血清干预的基础上加3-MA抑制自噬后，Occludin免疫共沉淀Caveolin-1条带相对灰度值较肠安Ⅱ号含药血清组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.001）；在肠安Ⅱ号含药血清干预的基础上应用ERK1/2抑制剂PD98059时，Occludin免疫共沉淀Caveolin-1条带相对灰度值较肠安Ⅱ号含药血清组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.001）。 研究结论 肠安Ⅱ号方可诱导Caco-2细胞自噬，并通过调节自噬减少Caveolin-1介导的紧密连接蛋白Occludin内吞降解，从而改善肠上皮机械屏障的完整性与大分子通透性，其作用机制可能与ERK1/2通路的激活有关。
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