摘要
背景 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种以认知功能障碍为主要临床特征的神经系统退行性疾病。在AD早期，嗅觉通路就已发生退行性改变，病变区域广泛涉及嗅上皮、嗅球和嗅觉皮层。由于嗅觉通路与边缘系统存在丰富的神经投射，因此嗅觉通路病变能够引起海马功能紊乱，进而损伤认知功能。研究表明，特定的气味刺激能够作用于嗅觉通路，缓解嗅觉通路神经元和突触的病理变化，对 AD 具有一定的治疗价值。 艾燃烧生成物是指在艾绒燃烧过程中产生的物质，艾烟是其主要组成部分。艾燃烧生成物具有独特的芳香气味和丰富的生物活性，是艾灸起效的关键因素之一。前期研究发现，艾燃烧生成物能够调节嗅球和海马的神经递质水平，改善AD的认知功能，该作用在阻断嗅觉后减弱，初步揭示艾燃烧生成物的起效途径可能与嗅觉通路相关。然而艾燃烧生成物对嗅觉通路的具体效应及作用机制尚不明确。 目的 观察艾燃烧生成物对AD模型小鼠学习记忆能力、特征性病理表现及神经元和突触形态结构变化的影响，并从嗅觉作用途径和 PI3K/AKT/GSK-3β 信号通路的角度探究艾燃烧生成物改善AD认知功能障碍的效应机制。 方法 为观察艾燃烧生成物对 AD 认知功能障碍的效应，实验一将 36 只 4 月龄雄性APP/PS1 小鼠随机均分为 AD 模型组（AD）、迷迭香精油组（AD + REO）、艾燃烧生成物组（AD + MCP）；12 只 C57BL/6 小鼠作为空白组（Control）。Control 组和 AD 组每日抓取固定，不做任何干预；AD + REO 组给予 1%迷迭香精油进行嗅闻作为阳性对照；AD + MCP 组接受 10~15 mg/m3的艾烟吸嗅干预。所有干预每日 1 次，每次 20 min，每周6天，共12周。干预后，先进行Morris水迷宫实验，随后检测嗅球、梨状皮层、海马中的Aβ表达、神经元形态、树突棘密度和突触超微结构变化。 为探究艾燃烧生成物改善AD认知功能障碍的嗅觉作用途径，实验二将48只4月龄雄性APP/PS1 小鼠随机均分为 AD 模型组（AD）、艾燃烧生成物组（AD + MCP）、嗅觉障碍组（AD + 3MI）、嗅觉障碍+艾燃烧生成物组（AD + 3MI + MCP）；12 只 C57BL/6小鼠作为空白组（Control）。对 AD + 3MI 组和 AD + 3MI + MCP 组腹腔注射 3-甲基吲哚（3-MI）进行嗅觉阻断，制备嗅觉障碍模型。Control 组、AD 组和 AD + 3MI 组每日抓取固定，不做任何干预；AD + MCP 组和 AD + 3MI + MCP 组给予 10~15 mg/m3的艾烟吸嗅干预。干预频次、时长和周期同实验一。干预后，依次进行埋藏食物小球实验和Morris水迷宫实验，随后检测嗅上皮OMP+细胞数量，以及嗅球、梨状皮层、海马中的Aβ表达、神经元形态、树突棘密度和突触超微结构变化。 为探究艾燃烧生成物经嗅觉通路改善 AD 认知功能障碍的作用机制，实验三将 45只 4 月龄雄性 APP/PS1 小鼠随机均分为 AD 模型组（AD）、艾燃烧生成物组（AD + MCP）、抑制剂+艾燃烧生成物组（LY + MCP）；15只C57BL/6小鼠作为空白组（Control）。对 LY + MCP 组小鼠腹腔注射 LY294002 抑制 PI3K/AKT/GSK-3β 通路表达。Control 组和 AD 组每日抓取固定，不做任何干预；AD + MCP 组和 LY + MCP 组给予 10~15 mg/m3的艾烟吸嗅干预。干预频次、时长和周期同实验一。干预后，先进行Morris水迷宫实验，随后检测嗅球、梨状皮层、海马中的p-Tau蛋白水平、神经元形态、树突棘密度和突触超微结构变化，以及PI3K/AKT/GSK-3β信号通路相关分子的表达。 结果 1. 学习记忆行为学 Morris 水迷宫实验结果显示，与 Control 组相比，AD 组逃避潜伏期显著延长（P ＜ 0.01），穿台次数、目标象限游程比和时间比显著减少（P ＜ 0.01, P ＜ 0.001, P ＜ 0.001）。与 AD 组相比，AD + REO 组逃避潜伏期显著降低（P ＜ 0.05），目标象限时间比显著升高（P ＜ 0.05）；AD + MCP 组逃避潜伏期也显著下降（P ＜ 0.05），目标象限游程比和时间比显著增加（均为 P ＜ 0.05）；二者的干预效果无统计学差异（P ＞ 0.05）。 2. 嗅觉通路中的 Aβ沉积 免疫荧光染色结果显示，与Control组相比，AD组嗅球、梨状皮层、海马的Aβ表达显著增加（均为 P ＜ 0.01）；与 AD 组相比，AD + REO 组和 AD + MCP 组嗅球、梨状皮层、海马的 Aβ 表达显著减少（均为 P ＜ 0.01）；与 AD + REO 组相比，AD + MCP 组梨状皮层的 Aβ 表达显著下降（P ＜ 0.05），嗅球和海马部位无统计学差异（P ＞ 0.05）。 3. 嗅觉通路中的神经元形态 尼氏染色结果显示，与Control组相比，AD组嗅球、梨状皮层、海马神经元排列松散，层次减少，形态不规则，尼氏体数量下降；与 AD 组相比，AD + REO 组和 AD +MCP组嗅球、梨状皮层、海马神经元排列有序，层次增加，形态规则，尼氏体数量增多。 4. 嗅觉通路中的树突棘密度 高尔基染色结果显示，与Control组相比，AD组嗅球、梨状皮层、海马的树突棘密度显著下降（均为P ＜ 0.001）。与 AD 组相比，AD + REO 组嗅球和海马的树突棘密度显著增加（P ＜ 0.05, P ＜ 0.001），梨状皮层处无显著差异（P ＞ 0.05）；AD + MCP 组嗅球、梨状皮层、海马的树突棘密度均显著增加（P ＜ 0.01, P ＜ 0.05, P ＜ 0.05）；二者的干预效果无统计学差异（P ＞ 0.05）。 5. 嗅觉通路中的突触超微结构 透射电镜结果显示，与Control组相比，AD组嗅球、梨状皮层、海马的突触后致密物显著变薄（均为P ＜ 0.001），突触间隙明显增宽（均为 P ＜ 0.001），嗅球和梨状皮层的突触界面曲率显著降低（P ＜ 0.001, P ＜ 0.01），海马处无统计学差异（P ＞ 0.05）。 与 AD 组相比，AD + REO 组嗅球、梨状皮层、海马的突触后致密物显著增厚（P ＜ 0.001, P ＜ 0.05, P ＜ 0.05），突触间隙显著减小（P ＜ 0.001, P ＜ 0.001, P ＜ 0.01），突触界面曲率无显著差异（P ＞ 0.05）；AD + MCP 组嗅球、梨状皮层、海马的突触后致密物也显著增厚（P ＜ 0.001, P ＜ 0.01, P ＜ 0.001），突触间隙显著减小（均为 P ＜ 0.001），嗅球和梨状皮层的突触界面曲率显著升高（均为 P ＜ 0.05），海马处无统计学差异（P ＞ 0.05）。 与 AD + REO 组相比，AD + MCP 组嗅球的突触后致密物厚度下降（P ＜ 0.05），其他指标均无统计学差异（P ＞ 0.05）。 6. 艾燃烧生成物的嗅觉作用途径 埋藏食物小球实验结果显示，Control 组、AD 组和 AD + MCP 组均能在 300 s 内找到埋藏的食物小球，AD + 3MI 组和 AD + 3MI + MCP 组的寻找时间均大于 300 s，表明嗅觉障碍造模成功。 研究结果显示，与 AD + MCP 组相比，AD + 3MI + MCP 组嗅上皮 OMP+细胞数量显著减少（P ＜ 0.001）；水迷宫实验的逃避潜伏期延长（P ＜ 0.05），目标象限游程比下降（P ＜ 0.05）；梨状皮层和海马中的 Aβ 表达增加（P ＜ 0.001, P ＜ 0.05）；嗅球、梨状皮层、海马神经元排列疏松，层次减少，形态不规则，尼氏体浅染或消失，树突棘密度下降（P ＜ 0.01, P ＜ 0.001, P ＜ 0.05），突触后致密物厚度、突触间隙宽度和突触界面曲率出现不同程度的损伤（P ＜ 0.05, P ＜ 0.01 或 P ＜ 0.001）。 7. 艾燃烧生成物调控 PI3K/AKT/GSK-3β 信号通路 研究结果显示，与 AD + MCP 组相比，LY + MCP 组在水迷宫实验的目标象限游程比和时间比明显降低（均为 P ＜ 0.05）；嗅球和海马中的 p-Tau 蛋白表达升高（均为 P ＜0.05）；嗅球、梨状皮层、海马神经元和突触的形态结构发生不同程度的病理改变，表现为神经元排列疏松，层次减少，形态不规则，尼氏体数量下降，树突棘密度降低，突触后致密物变薄和突触间隙增宽（P ＜ 0.05, P ＜ 0.01 或 P ＜ 0.001）；此外，嗅球、梨状皮层、海马中的 PI3K、AKT mRNA 和蛋白表达降低（P ＜ 0.05, P ＜ 0.01 或 P ＜ 0.001）， GSK-3β mRNA和蛋白表达升高（P ＜ 0.05 或 P ＜ 0.01）。 结论 1. 艾燃烧生成物吸嗅干预能够提高 APP/PS1 小鼠的学习记忆能力，降低嗅球、梨状皮层和海马中的Aβ沉积，减少神经元丢失，增加树突棘密度，调节突触结构变化，改善AD的认知功能障碍。 2. 嗅觉通路是艾燃烧生成物的重要作用途径，艾燃烧生成物能够通过嗅觉通路降低嗅球、梨状皮层和海马中的Aβ表达，缓解神经元和突触的形态结构损伤，发挥改善AD认知功能障碍的作用。 3. PI3K/AKT/GSK-3β 信号通路是艾燃烧生成物的效应机制之一，艾燃烧生成物能够通过调控PI3K/AKT/GSK-3β 信号通路，减少嗅球、梨状皮层和海马中的 p-Tau 蛋白表达，保护神经元和突触的形态结构，提高突触可塑性，改善AD的认知功能障碍。
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