摘要
背景 动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性心脏病和缺血性脑卒中等疾病发生发展的关键病理基础，严重威胁全世界人民的健康。颈动脉粥样硬化（ carotid atherosclerosis，CAS）疾病有较大的患病人群，是心脑血管疾病的重要危险因素和预测因素。如何有效的防治 CAS，减少心脑血管事件的发生，是当前临床面临的重大课题。AS 具有复杂的病理机制，细胞凋亡在 AS 全程发挥重要的作用，因此成为治疗AS的重要靶点。血瘀证与 AS密切相关，脉管复康片由丹参、鸡血藤、郁金、乳香、没药五味中药组成，具有活血化瘀、通经活络的功效。基于此，本研究拟通过开展随机对照临床研究、蛋白质组学、网络药理学和动物实验四大部分，探讨脉管复康片干预AS的临床疗效与作用机制。 目的 1.通过多中心、前瞻性、开放标签、终点盲法、随机对照的临床研究设计方法，客观评价脉管复康片治疗颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis，CAS）的临床疗效及安全性，为临床提供可靠证据。 2.应用蛋白质组学技术，筛选鉴定与脉管复康片治疗 CAS 相关的血浆差异表达蛋白，探讨脉管复康片治疗CAS的作用机制。 3.运用网路药理学预测脉管复康片抗动脉粥样硬化的潜在药理机制，为进一步实验验证提供理论依据。 4.通过动物实验评价脉管复康片对 ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的干预效果，并初步验证脉管复康片抗动脉粥样硬化的作用机制。 方法 1.临床研究：收取中国中医科学院西苑医院、辽宁省人民医院、河南中医药大学第一附属医院2021年12月-2023年7月诊断为颈动脉粥样硬化性斑块的患者。试验组给予生活方式调整+脉管复康片一次4片，3次/日，对照组为单纯生活方式调整，干预时间为 24周。观察治疗前后患者颈动脉内中膜厚度、斑块面积、最大斑块厚度、斑块逆转有效率、颈动脉狭窄率、血流动力学参数、血瘀证评分、炎性因子、血脂等指标变化。 2. 蛋白质组学研究：从临床研究的试验组中选取临床疗效显著的 10例患者，同时选取未服药的疾病组和健康正常组各 10例，采集患者血浆。运用 4D-DIA蛋白质组学检测技术，对各组样本进行蛋白质提取、酶解、脱盐、分级分离后，进行 LC-MS/MS 分析的DDA建库和DIA分析，最终筛选出三组的差异蛋白并进行生物信息学分析。 3.网络药理学研究：利用 HERB 和 Swiss Target Prediction 数据库获得脉管复康片活性成分及作用靶点，并结合已有文献加以补充。利用疾病数据库获得 AS 相关靶点。利用STRING数据库构建PPI蛋白网络，DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。 4.药效学研究：高脂饲料饲养 ApoE-/-小鼠 8 周构建 AS 模型后，分为模型组、阿托伐他汀组、脉管复康片高剂量组和脉管复康片低剂量组， C57BL/6J小鼠作为空白对照，相应药物干预 6 周。运用小动物超声检测小鼠主动脉弓脉搏波传播速度、颈动脉内中膜厚度、血管阻力指数及脉搏搏动指数；大体油红评估全主动脉斑块面积；油红O染色、HE染色、Movat染色分别评估主动脉窦斑块脂质含量、坏死核心面积、泡沫细胞及胶原含量；全自动生化分析仪检测血脂水平。 5.作用机制研究：分组及喂养过程同药效学研究，采用 ELISA 法检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17炎症因子水平，TUNEL染色检测细胞凋亡水平， qPCR法检测 PI3K、AKT、Caspase3、Caspase9、Bcl-2及 Bax的 mRNA表达，免疫组化法检测斑块内 Cleaved-caspase 3、Bcl-2 及 Bax 蛋白的表达，免疫荧光同源双标染色法检测斑块内PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白的表达。 结果 1. 临床研究共纳入 92例患者，研究过程中试验组脱落 4例，对照组脱落 1例，最终纳入分析 87 例。两组患者治疗前基线平等。治疗 24 周后，与对照组相比，试验组患者的右侧颈总动脉内中膜显著降低、斑块逆转有效率显著提高（P＜0.05），斑块面积、狭窄率均有所减小，但差异无统计意义（P＞0.05）。两组患者治疗前后血流动力学指标无明显变化（P＞0.05）。与对照组相比，试验组能显著降低血瘀证积分（P＜0.05）。此外，试验组能显著提高 HDL-C水平（P＜0.05）。两组治疗前后的 ALT、Cr及尿酸水平无显著差异，本试验过程中，对照组有 1 例患者出现不良事件，诊断为脑卒中，除此之外试验组与对照组患者均未出现药物不良反应。 2.蛋白质组学研究共筛选出 35 个差异表达蛋白，其中调整反向相反的共有 21 个。在 21个共同差异表达蛋白中，与 CAS组相比， MGFK组有 16个上调蛋白及 5个下调蛋白。蛋白质互作网络结果显示，共有 8 个差异蛋白具有紧密的功能联系，分别为CD36、CD47、TPM3、TPM4、TMED10、PCSK9、ICAM3和F11R。GO和KEGG富集分析结果显示，共同差异表达蛋白主要与细胞黏附、正向调节 T 细胞活化等生物学过程，内质网与高尔基体运输泡等细胞组分，低密度脂蛋白颗粒结合等分子功能以及细胞粘附等信号通路密切相关。 3. 网络药理学研究筛选得到脉管复康片 64个活性成分及其对应的 200个药物作用靶点， 4348个 AS疾病靶点，146个脉管复康片抗 AS作用靶点。脉管复康片抗 AS的核心成分为槲皮素、木犀草素、丹酚酸 A、芹菜素、丹酚酸 B 等。PPI 结果显示，脉管复康片抗 AS的主要靶点可能为蛋白激酶 B1（AKT1）、信号转导及转录激活因子 3 （STAT3）、表皮生长因子受体（EGFR）、酪氨酸激酶（SRC）、半胱天冬酶 3（CASP3）等。GO 和 KEGG 富集分析结果显示，脉管复康片可能通过参与细胞凋亡过程的负调控、蛋白质自身磷酸化、蛋白激酶 B 信号传导的正向调节等生物学过程，调控脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抵抗、PI3K-AKT信号通路、细胞凋亡等信号通路发挥抗AS作用。 4. 与模型组相比，脉管复康片高低剂量组的主动脉弓 PWV、颈总动脉 RI和 PI均显著改善；各给药组均可显著降低全主动脉斑块面积、斑块面积以及斑块面积脂质含量（P＜0.05）；阿托伐他汀组和脉管复康片高剂量组能显著降低斑块坏死核心区占比（P＜0.05）；各药物干预组泡沫细胞占比均显著降低（P＜0.05），且胶原纤维占比均显著增加（P＜0.05）。血脂方面，阿托伐他汀组和脉管复康片高剂量组相较于模型组 TC水平显著降低，HDL-C水平显著提高(P＜0.05)。 5.与模型组相比，脉管复康高剂量片组各炎症因子水平均有不同程度改善，尤其显著降低 TNF-α、IL-1β 水平，提高 IL-17 水平（P＜0.05）；TUNEL 阳性率显著降低（P＜0.05）； Caspase3、Caspase9的 mRNA水平均显著降低（P＜0.05），PI3K、AKT、Bax的mRNA水平均有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化结果显示，与模型组相比，脉管复康片高低剂量组的 Cleaved-caspase 3、Bax 水平均显著降低（P＜0.05）。免疫荧光结果显示，与模型组相比，脉管复康片高剂量组能显著提高 p-PI3K /PI3K、p-AKT/AKT百分比（P＜0.05）。 结论 临床研究表明，脉管复康片能在一定程度上降低颈动脉内中膜厚度，提高斑块逆转有效率，延缓 AS进展，改善患者血瘀症状，提高患者 HDL-C水平，调节血脂代谢，且临床使用过程中不影响患者肝肾功能水平，安全性高。蛋白质组学与网络药理学表明，脉管复康片可能通过参与细胞黏附、T 细胞活化等生物学过程，影响内质网至高尔基体蛋白质囊泡运输和低密度脂蛋白颗粒结合，参与调控细胞凋亡、炎症反应及脂质代谢等方面发挥抗 AS 的作用。动物实验表明，脉管复康片能够改善 ApoE-/-小鼠血脂水平、炎症反应和血流动力学，减少主动脉大体斑块面积，减少主动脉窦斑块面积、坏死核心面积和泡沫细胞含量，且升高斑块内胶原纤维含量，可能是通过激活PI3K/AKT/ Caspase3信号通路，减轻 AS小鼠主动脉细胞凋亡程度，发挥抗 AS的作用。
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