摘要
【研究背景】 肺癌是目前全球死亡率第一，男性发病率第一、女性第二的恶性肿瘤，约占2020年诊断癌症的 11.4%和死亡癌症的 18.0%。肺腺癌（lung adenocarcinoma ,LUAD）是非小细胞肺癌最常见的组织亚型，约占总肺癌发病率的40%。30%的肺腺癌患者在诊断初期是可以手术的，然而所有患者在接受肿瘤切除术后，都仍存在肿瘤复发转移的风险，且分期越高，风险度越高。肺癌手术切除术后前两年内癌症的复发和转移的概率大于50%，进展到中晚期后一般采用放射、化疗、免疫、介入及靶向等治疗加以控制、延缓病情进展。国家级名老中医王沛教授总结多年临床经验，以“益气养阴、化痰散结”立法，创立养肺方。在我们前期研究基础上，已经证实了养肺方针对肺癌晚期患者具有良好的治疗效果，可明显减轻临床症状，提高患者的生活质量，延长中位生存期。养肺方作为本科室的特色处方，其疗效在临床上得到了多次的证实，但目前研究仍以临床方面的研究为主，养肺方治疗肺腺癌的药效物质基础及分子作用机制的研究报道很少，此研究具有重大意义。 【研究目的】 1、利用网络药理学的方法，预测了养肺方对肺腺癌的可能作用靶点和生物学通路。 2、建立肺腺癌小鼠模型，研究养肺方在临床上对肺腺癌的效果，并初步验证网络药理学筛选的信号通路，以探索养肺方治疗肺腺癌的作用机制，为将来临床应用养肺方治疗肺腺癌提供科学依据。 【研究方法】 1.通过TCMSP数据库、HERB数据库和PubChem数据库预测的养肺方相关靶点；使用GeneCards数据库、OMIM数据库、TDD数据库和DisGeNET数据库收集肺腺癌的潜在治疗靶点；使用在线程序 Venny 2.1.0 对养肺方和肺腺癌的靶基因进行交集分析，以获得养肺方和肺腺癌的共同靶点；基于STRING平台构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，利用Cytoscape软件进行可视化分析，筛选出核心基因；利用R3.6.0软件进行GO和KEGG富集分析，筛选可能的作用通路。结果发现：EGFR/PI3K-AKT-mTOR信号通路是养肺方治疗肺腺癌的核心通路之一。 2.采用Lewis肺癌细胞建立小鼠皮下移植瘤肺癌模型，将小鼠按照随机数字表法分为模型组、养肺方低剂量组、养肺方中剂量组、养肺方高剂量组4组，每组6只。模型组给予 0.1 ml 生理盐水，实验组分别给予浓度为 0.1g/ml、0.2g/ml、0.4g/ml 的养肺方药液 0.1 ml。1 次/天，持续 14 天。末次给药后，全部小鼠禁食不禁水过夜，次日于实验室腹腔麻醉 0.3 ml，取小鼠肿瘤组织并称重，2/3 用福尔马林固定，1/3 液氮速冻后转入-80度冰箱冻存。福尔马林固定的小鼠肿瘤组织进行石蜡包埋及切片，进行HE染色检查组织损伤情况。免疫组化测肿瘤组织中下游指标4EBP1与SK61阳性表达率. Western Blot 检测肿瘤组织中 EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 蛋白质表达量。RT-qPCR检测肿瘤组织中EGFR、AKT、mTOR中mRNA相对定量表达情况。ELISA测血清与肿瘤组织中EGFR-AKT-mTOR通路的下游指标4EBP1、S6K1的浓度。初步验证养肺方通过EGFR/PI3K-AKT-mTOR通路抑制肺腺癌的发展。 【研究结果】 1、在本次的研究中，通过数据库检索发现养肺方的有效成分94个，去重后得到养肺方有效基因靶点共251个，疾病靶点1444个；药物与疾病的交集靶点一共134个。养肺方治疗肺腺癌的核心有效成分包括槲皮素、木犀草素、Β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、山奈酚、豆甾醇、黄芩素、金合欢素、黄豆黄素、薯蓣皂素。PPI网络揭示养肺方与肺腺癌的核心靶点有密切的关联，其中排在最前面的有STAT3、AKT1、IL-6、EGFR、IL-1B等。充分体现了养肺方治疗肺腺癌具有多靶点多成分的特点。GO富集显示其参与的生物过程涉及对活性氧的反应、细胞对化学应激的反应、上皮细胞增殖、对氧化应激的反应、腺体发育、紫外线反应、上皮细胞凋亡进程、固有凋亡信号途径、细胞器外膜、隔膜筏、膜微区、线粒体外膜、RNA 聚合酶 Ⅱ 转录调节复合物等 94 个。KEGG富集结果显示涉及到的信号通路：晚期糖基化终产物极其受体（AGE-RAGE）、IL-17 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信号通路、TNF信号通路、JAK-STAT 信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、mTOR信号通路、cAMP信号通路、AMPK信号通路等148条。结合药物共同作用靶点分析得到的主要信号通路为EGFR/PI3K-AKT-mTOR信号通路。 2、小鼠的生长曲线和肿瘤体积提示养肺方可以增加小鼠体重，减缓肿瘤体积的增长速度，且有效的提高小鼠肿瘤的抑瘤率。HE的染色结果显示，养肺方能通过促进肿瘤组织的坏死，增强对肿瘤的清除作用。免疫组化结果表明养肺方可以降低4EBP1和SK61在肿瘤组织中的阳性表达率。我们从蛋白水平和基因水平都探讨了养肺方对EGFR/PI3K-AKT-mTOR 通路的调节作用。Western Blot 检测结果提示中药干预后， EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达量均降低。PCR检测中， EGFR mRNA表达呈下降趋势，AKT mRNA 表达呈下降趋势，与低剂量组相比，养肺方中剂量组与高剂量组 EGFR、AKT、mTOR 基因表达呈下降趋势，这表明 EGFR 、AKT、mTOR转录减少，翻译后修饰减少，蛋白表达量也减少。ELISA结果表明，4EBP1与SK61浓度均降低，且随着养肺方剂量增加，浓度呈下降趋势，与免疫组化结果一致，表明养肺方通过抑制EGFR/PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制4EBP1、SK61的合成，达到治疗肺腺癌的效果。 【研究讨论】 1、养肺方通过多靶点，多通路治疗肺腺癌，EGFR/PI3K-AKT-mTOR信号通路是核心通路之一。 2、养肺方可以增加小鼠体重，减缓肿瘤生长速度，有效提高抑瘤率。 3、养肺方通路通过调控EGFR、mTOR、AKT蛋白的表达，抑制EGFR/PI3K-AKT-mTOR信号传导过程。 4、养肺方通过抑制EGFR/PI3K-AKT-mTOR信号通路，抑制4EBP1、SK61的合成，抑制肺腺癌的增殖和生长。
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